马尿酸钠水解试验

发布时间：2025-06-20 10:39:37 阅读量：9 作者：生物检测中心
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马尿酸钠水解试验：原理、方法与临床意义

一、试验目的 马尿酸钠水解试验是一种经典的生化试验，主要用于鉴别革兰阳性球菌，特别是链球菌属中的不同种群（如B群链球菌与其他β-溶血性链球菌），以及辅助鉴定某些其他细菌（如李斯特菌属、弯曲菌属）。

二、试验原理 本试验基于细菌是否产生 马尿酸盐水解酶（Hippuricase）。

  1. 底物水解： 某些细菌能够水解马尿酸钠（甘氨酸钠与苯甲酸的结合物）。
  2. 产物生成： 水解反应产生甘氨酸和苯甲酸。
  3. 检测苯甲酸： 试验的关键在于检测生成的苯甲酸。常用方法有两种：
    • 氯化铁法（经典试管法）： 加入三氯醋酸沉淀培养基中的蛋白质后，取上清液再加入氯化铁试剂。苯甲酸与氯化铁结合生成稳定的苯甲酸铁复合物，呈现持久不褪的棕褐色至褐色沉淀。未水解的马尿酸钠与氯化铁则形成短暂的黄褐色沉淀，摇动后消失。
    • 茚三酮法（快速法，常用于链球菌鉴定）： 利用水解产生的甘氨酸。加入茚三酮试剂后，在特定条件下（通常需要加热），甘氨酸与茚三酮反应生成蓝紫色至紫色化合物。

三、试验材料与方法

  1. 培养基或试剂：
    • 马尿酸钠肉汤基础法： 含1%马尿酸钠的肉汤培养基（如脑心浸液肉汤、胰酶大豆肉汤）。
    • 快速微量法（常用）： 含1%马尿酸钠的磷酸盐缓冲液（0.02 M, pH 7.4）。
    • 检测试剂：
      • 氯化铁法： 三氯醋酸溶液（12%或24%）、氯化铁试剂（12% FeCl₃·6H₂O溶于2%盐酸中）。
      • 茚三酮法： 茚三酮试剂（3.5g茚三酮溶于100mL丙酮与丁醇1:1的混合液中，或商用配方）。
  2. 操作步骤：
    • 氯化铁法（试管法）：
      1. 将纯培养的待测细菌接种于马尿酸钠肉汤中。
      2. 35±2°C培养24-48小时（通常48小时以确保充分反应）。
      3. 取培养物1.8 mL（或适量）加入试管。
      4. 加入0.2 mL三氯醋酸溶液（12%），混匀，静置10-15分钟使蛋白质沉淀。
      5. 以适当速度离心（如3000 rpm，10-15分钟），吸取澄清上清液1.0 mL至另一干净试管。
      6. 沿管壁缓慢加入0.2-0.4 mL氯化铁试剂（勿摇动），立即观察两液面交界处。
    • 茚三酮法（快速法）：
      1. 取0.4 mL含1%马尿酸钠的磷酸盐缓冲液于小试管中。
      2. 挑取浓厚的待测细菌纯培养菌苔（通常需18-24小时培养物）加入缓冲液中，制成浓厚菌悬液。
      3. 35±2°C培养2小时。
      4. 加入0.2 mL茚三酮试剂，混匀。
      5. 继续35±2°C培养10-30分钟（或室温放置15-30分钟）。有些方法建议室温放置即可显色。
      6. 观察颜色变化。
  3. 质量控制：
    • 阳性对照菌： B群链球菌（如ATCC 13813）。
    • 阴性对照菌： A群链球菌（如ATCC 19615）或D群肠球菌。
    • 试剂对照： 不加菌的培养基/缓冲液+试剂，应无颜色变化（茚三酮法）或无持久沉淀（氯化铁法）。

四、结果判读

  • 氯化铁法（试管法）：
    • 阳性结果 (+)： 加入氯化铁试剂后，在液体界面处立即形成持久不褪的棕褐色至深褐色沉淀或环状物（苯甲酸铁）。摇动后沉淀仍存在。
    • 阴性结果 (-)： 仅有短暂的黄褐色沉淀或无沉淀形成，摇动后沉淀消失或无变化。
  • 茚三酮法（快速法）：
    • 阳性结果 (+)： 呈现深紫色或蓝紫色（表示有甘氨酸生成）。
    • 阴性结果 (-)： 保持无色或淡粉色（通常为试剂本身的颜色）。

五、临床意义与解读

  • B群链球菌鉴定： 马尿酸钠水解试验是鉴定B群链球菌（无乳链球菌， Streptococcus agalactiae） 的关键试验。绝大多数（>99%）B群链球菌马尿酸钠水解试验阳性。这对于围产期孕妇筛查、新生儿感染诊断至关重要。
  • 鉴别其他链球菌：
    • A群（化脓链球菌）、C群、G群β-溶血链球菌通常为阴性。
    • D群肠球菌通常为阴性（但偶有阳性报告）。
    • 牛链球菌通常为阳性（但常被归入D群，需结合其他试验区分）。
    • 草绿色链球菌群结果不定，但非主要鉴别依据。
  • 其他细菌鉴定：
    • 单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）： 通常为阳性，是其重要的鉴定特征之一。
    • 空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）： 通常为阳性，是其鉴定试验之一（常与触酶、氧化酶等结合判断）。
    • 其他： 某些厌氧菌（如某些放线菌）也可能阳性，但非主要用途。

六、注意事项与局限性

  1. 菌量充足： 快速法中细菌接种量必须足够（浓厚菌悬液），否则可能导致假阴性。
  2. 培养时间： 试管法需足够长的培养时间（通常48小时）。快速法时间不足或过长也可能影响结果。
  3. 试剂质量与操作：
    • 氯化铁法需严格按步骤操作（沉淀蛋白、离心取上清、加试剂不摇动）。
    • 茚三酮试剂需新鲜配制或妥善保存（避光冷藏），避免失效导致假阴性。
    • 茚三酮法加热需适度，过度加热可能导致背景色加深干扰判读。
  4. 结果判读：
    • 氯化铁法需观察“持久”沉淀（>10-15分钟不消失）。
    • 茚三酮法紫色需足够深（明显深于阴性对照）。弱阳性或可疑结果需重复试验或用其他方法确认。
  5. 局限性：
    • 并非所有B群链球菌都阳性（极罕见阴性株）。
    • 非B群链球菌偶有阳性（如某些牛链球菌、个别肠球菌等）。
    • 不能单独依赖此试验做最终鉴定： 必须结合菌落形态、溶血特征、革兰染色、触酶试验及其他生化试验（如CAMP试验、PYR试验等）进行综合判断。

七、结论 马尿酸钠水解试验是一项操作相对简便、成本较低且结果可靠的生化试验，尤其在**快速鉴定B群链球菌（无乳链球菌）**方面具有重要价值。理解其原理，严格按照标准化操作步骤进行，并结合阳性和阴性对照以及与其他试验结果的综合分析，是确保结果准确、为临床提供可靠微生物学诊断依据的关键。