醋酸钠利用试验

醋酸钠利用试验操作流程与结果判读

摘要： 醋酸钠利用试验是一种用于鉴别微生物（主要是细菌）能否以醋酸钠作为唯一碳源进行生长代谢的经典生化试验。该试验对于区分肠杆菌科细菌及其他某些菌属具有重要意义，是临床微生物学和环境微生物学鉴定的常规手段之一。

一、实验原理

醋酸钠利用试验基于微生物对不同碳源的代谢能力差异。试验培养基中以醋酸钠作为唯一的碳来源。能够利用醋酸钠的微生物，在其生长过程中代谢醋酸钠盐，产生碱性终产物（主要是碳酸钠盐），导致培养基的pH值显著升高。培养基中添加的溴麝香草酚蓝（BTB）指示剂在碱性条件下（pH > 7. 6）由绿色变为深蓝色或普鲁士蓝色。不能利用醋酸钠的微生物则无法在该培养基上生长或仅微弱生长，不产生明显的pH变化，指示剂保持绿色或仅轻微变化（可能因利用蛋白胨产微量酸而变黄）。

二、材料与试剂

1. 培养基： 醋酸钠培养基基础。
   • 成分 (示例配方，具体比例参照标准培养基说明书)：
     • 醋酸钠 (Sodium Acetate)：2.0 g
     • 氯化钠 (Sodium Chloride)：5.0 g
     • 硫酸镁 (Magnesium Sulfate)：0.2 g
     • 磷酸二氢铵 (Ammonium Phosphate, Monobasic)：1.0 g
     • 磷酸氢二钾 (Potassium Phosphate, Dibasic)：1.0 g
     • 溴麝香草酚蓝 (Bromothymol Blue)：0.08 g
     • 琼脂 (Agar)：15.0 g (液体培养基则不加)
     • 蒸馏水 (Distilled Water)：1000 mL
   • 最终 pH： 6.8 - 7.0 (灭菌后)。
2. 灭菌器材： 无菌试管、无菌吸管/移液器及枪头、无菌接种环。
3. 对照菌株 (推荐)：
   • 阳性对照： 已知能利用醋酸钠的菌株 (如：产碱杆菌属 Alcaligenes spp.，铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa)。
   • 阴性对照： 已知不能利用醋酸钠的菌株 (如：大肠埃希菌 Escherichia coli)。
4. 待测菌株： 纯培养物。
5. 恒温培养箱： 通常设定为35 ± 2°C。

三、试验操作步骤

1. 培养基制备：
   • 称取规定量的脱水培养基干粉或按比例混合各成分。
   • 加入蒸馏水，搅拌加热至完全溶解。
   • 分装于带螺旋盖或硅胶塞的试管中（斜面培养基约4-5mL/管，制成斜面；或作为液体培养基分装）。
   • 高压灭菌： 121°C (15磅压力) 高压蒸汽灭菌15分钟。
   • 冷却凝固： 灭菌后，若制备琼脂斜面，将试管倾斜放置，冷却凝固形成斜面（斜面长度适中，底部有约1cm深的琼脂柱）。
2. 接种：
   • 使用无菌操作技术。
   • 取待测菌和对照菌（阳性、阴性）的18-24小时新鲜纯培养物。
   • 固体斜面： 用无菌接种环挑取单菌落，在斜面上轻轻划线接种（避免划破琼脂表面）。
   • 液体培养基： 用无菌接种环或移液器将少量菌苔接入液体中（或穿刺接种）。
3. 培养：
   • 将接种好的试管（及未接种的空白对照管）放入恒温培养箱。
   • 培养温度： 通常35 ± 2°C。
   • 培养时间： 24小时和48小时后分别观察结果。某些生长缓慢的菌株可能需要培养至7天（需根据菌种的生长特性确定）。
4. 结果观察与判读：
   • 在规定的培养时间后取出试管。
   • 观察：
     • 首先观察有无生长（菌苔或浑浊）。
     • 重点观察培养基颜色的变化，特别是斜面培养基的上部或液体培养基的整个液柱。
   • 判读标准：
     • 阳性结果 (+)： 培养基颜色由绿色变为明显的深蓝色或普鲁士蓝色。即使生长量不多，只要颜色发生典型的碱性变化即可判为阳性。通常在斜面上部颜色变化更显著。
     • 阴性结果 (-)： 培养基颜色保持不变（绿色），或变黄（由于微生物少量利用培养基中的蛋白胨或其他氮源产酸所致）。即使有微量生长，只要没有出现碱性（蓝色）变化即判为阴性。
     • 无生长： 培养基保持原始绿色，无可见菌苔或浑浊，表明该菌无法在此培养基上生长，结果也判为阴性。

四、质量控制

• 每次试验必须同时接种阳性对照菌和阴性对照菌。
• 阳性对照：应在24-48小时内出现典型的蓝色阳性反应。
• 阴性对照：培养基应保持绿色或变黄，不应变蓝。
• 未接种的空白培养基管：应保持原始绿色。
• 只有对照菌株的结果符合预期，本次试验的结果才被视为有效可靠。

五、注意事项

1. 无菌操作： 整个接种过程必须在无菌条件下进行，避免杂菌污染导致假阳性或假阴性。
2. 菌种纯度： 待测菌必须是新鲜（18-24小时）的纯培养物。污染菌会干扰结果判读。
3. 接种量： 接种量不宜过大，以免带入过多其他营养物质干扰醋酸钠作为唯一碳源的特性。微量的接种即可。
4. 培养基保存： 制备好的培养基应避光冷藏保存（2-8°C），并在有效期内使用。使用前检查有无污染、脱水或颜色异常。
5. 指示剂敏感性： 溴麝香草酚蓝的变色范围为pH 6.0 (黄色) 到 pH 7.6 (蓝色)。轻微的颜色变化可能难以判断（如蓝绿），需仔细与对照比较，并结合生长情况综合判断。
6. 培养时间： 严格遵守规定的培养时间。过早读取可能导致假阴性（反应尚未发生），过晚读取可能因微生物死亡或过度生长产生次级代谢物干扰颜色或出现假阳性（部分菌可能后期微弱利用）。
7. 结果解读： 结果判读应基于培养基颜色的显著变化。轻微或可疑的颜色变化应视为阴性，或考虑重复试验。颜色变化是主要判读依据，生长情况是辅助参考。
8. 安全： 遵循实验室常规安全规范处理废弃培养基和菌种。

六、应用与意义

醋酸钠利用试验主要用于细菌属或种的鉴别，尤其在以下方面：

• 区分肠杆菌科细菌： 例如，产气肠杆菌 (Enterobacter aerogenes) 通常为乙酸钠利用阳性，而大肠埃希菌 (Escherichia coli) 为阴性；肺炎克雷伯菌 (Klebsiella pneumoniae) 通常阳性，而阴沟肠杆菌 (Enterobacter cloacae) 多为阴性（但存在变异）。
• 鉴定非发酵菌：
  • 洋葱伯克霍尔德菌 (Burkholderia cepacia) 通常阳性。
  • 铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) 几乎总是强阳性（快速变蓝）。
  • 不动杆菌属 (Acinetobacter spp.) 多为阴性。
  • 产碱杆菌属 (Alcaligenes spp.) 多为阳性。
• 环境微生物研究： 用于评估环境中微生物利用特定有机酸（乙酸）的能力，指示微生物群落的功能或特定降解途径的存在。
• 辅助鉴定： 通常是微生物鉴定系统（如API, VITEK, 传统生化管系列）中的一项重要测试，需与其他生化试验结果联合分析才能对菌株做出准确鉴定。

结论：

醋酸钠利用试验是一个操作相对简单、成本较低的经典生化试验。通过准确观察培养基颜色的碱性变化（绿色→蓝色），可以有效判断微生物是否具有利用醋酸钠作为唯一碳源的能力。严格遵守标准化操作流程和质量控制措施对于确保试验结果的准确性和可靠性至关重要。该试验在临床病原菌鉴别和环境微生物功能评估中具有重要的应用价值。