丙二酸盐利用试验：原理、操作与临床意义
丙二酸盐利用试验是微生物学鉴定中一项重要的生化试验，主要用于鉴别肠杆菌科细菌，特别是辅助区分柠檬酸杆菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属、沙门菌属及志贺菌属等成员。
一、 试验原理
- 底物与代谢途径： 该试验的核心在于检测细菌能否利用丙二酸钠（Malonate）作为生长繁殖所需的唯一碳源。
- 关键酶： 细菌利用丙二酸盐的能力依赖于其体内是否存在特定的酶系，能够将丙二酸盐分解代谢并产生碱性终产物。
- pH变化与指示剂： 当细菌成功利用丙二酸盐时，会代谢产生碳酸氢盐或氢氧化钠等碱性物质，导致培养基的pH值显著升高。
- 指示剂显色： 培养基中加入的酸碱指示剂（通常是溴麝香草酚蓝）对pH变化敏感。在碱性条件下，溴麝香草酚蓝由绿色（中性）转变为深蓝色或蓝绿色（碱性）。
- 结论：
- 阳性结果： 培养基颜色由绿变为深蓝或蓝绿色，表明该菌株能够利用丙二酸盐作为唯一碳源生长并产碱。
- 阴性结果： 培养基颜色保持绿色或变为黄色（如果细菌利用酵母膏产酸），表明该菌株不能利用丙二酸盐作为唯一碳源生长，或者其代谢活动不足以产生明显碱性变化。
二、 培养基与试剂
- 丙二酸盐肉汤基础培养基：
- 丙二酸钠：作为唯一碳源。
- 酵母浸膏：提供氮源、维生素和生长因子。
- 硫酸铵：补充氮源。
- 磷酸盐缓冲系统：维持培养基初始pH稳定。
- 氯化钠：维持渗透压。
- 溴麝香草酚蓝： pH指示剂（0.025g/L或按配方要求）。初始pH通常调节至7.3左右，呈现绿色。
- 形式： 常制成液体培养基（肉汤）或斜面形式。液体形式观察颜色变化更直观。
三、 试验操作步骤
- 培养基准备：
- 根据说明书准确称量市售成品脱水培养基干粉（或按标准配方配制），加入蒸馏水溶解。
- 分装于合适的试管中。
- 高压蒸汽灭菌（通常121°C，15分钟）。
- 灭菌后无菌操作条件下取出，冷却至室温备用。最终培养基应呈绿色。
- 接种：
- 从待测菌株的纯培养物（通常为18-24小时新鲜培养物）挑取单个菌落。
- 对于液体培养基，将菌落接种于肉汤中。也可采用穿刺接种（如果使用含琼脂的斜面或高层）。
- 对于斜面培养基，同时进行斜面划线接种和底部穿刺接种。
- 培养：
- 将接种后的培养基置35-37°C恒温培养箱中培养。
- 标准培养时间：通常为24-48小时。 有些生长缓慢的菌株可能需要延长至48小时甚至72小时观察结果。
- 结果判读：
- 在规定的培养时间后取出培养基。
- 阳性反应 (+)：培养基颜色由绿色变为深蓝色或蓝绿色（指示碱性pH）。有时仅在培养基表面或穿刺线周围出现深蓝色环。
- 阴性反应 (-)：培养基颜色保持绿色不变，或由于细菌利用酵母膏产酸而变为黄色。
- 记录： 清晰记录观察到的颜色变化（蓝色/蓝绿色为阳性；绿色/黄色为阴性）。
四、 临床应用与意义
丙二酸盐利用试验最主要的应用价值在于辅助鉴别肠杆菌科内的不同属和种：
- 鉴别克雷伯菌属与大肠埃希菌：
- 克雷伯菌属细菌（如肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、臭鼻克雷伯菌）通常为阳性（+）。
- 大肠埃希菌通常为阴性（-）（这是两者鉴别的关键试验之一）。
- 鉴别沙门菌属的亚种：
- 亚利桑那沙门菌（现归为肠道沙门菌亚利桑那亚种）通常为阳性（+）。
- 绝大多数其他沙门菌（如伤寒沙门菌、肠炎沙门菌等）通常为阴性（-）。
- 鉴别志贺菌属与不活泼大肠埃希菌/类志贺邻单胞菌： 部分不活泼大肠埃希菌和类志贺邻单胞菌可能为阳性，而志贺菌属通常为阴性。
- 区分肠杆菌科内其他细菌：
- 枸橼酸杆菌属：反应不定，不同种有差异（如弗劳地枸橼酸杆菌常阳性）。
- 肠杆菌属：反应不定（如产气肠杆菌常阳性，阴沟肠杆菌常阴性）。
- 哈夫尼亚菌属：通常阴性。
- 沙雷菌属：通常阴性。
- 变形杆菌属：通常阴性。
- 摩根菌属：通常阴性。
- 普罗威登斯菌属：通常阴性。
- 耶尔森菌属：通常阴性。
重要提示：
- 联合使用： 丙二酸盐利用试验结果需结合革兰染色、菌落形态、氧化酶试验以及其他关键的生化试验（如TSI、IMViC、尿素酶、赖氨酸脱羧酶、动力、H2S产生等）结果进行综合判断才能准确鉴定细菌。
- 非绝对特异性： 存在例外情况，阳性或阴性反应并非某个属或种的绝对特征。例如，部分大肠埃希菌罕见变异株也可能呈阳性。务必参考可靠的鉴定流程图或数据库。
- 标准化操作： 接种菌量、培养温度和时间必须标准化，以确保结果的可靠性。使用新鲜（18-24小时）纯培养物接种。过度生长或培养时间过长可能导致假阳性或假阴性。
- 质量控制： 使用标准参考菌株定期进行质控至关重要：
- 阳性对照菌株：肺炎克雷伯菌（预期结果：阳性，培养基变蓝）。
- 阴性对照菌株：大肠埃希菌（预期结果：阴性，培养基保持绿色或变黄）。
- 未接种培养基也应保持绿色作为对照。
五、 总结
丙二酸盐利用试验是基于细菌利用特定有机酸盐（丙二酸钠）作为唯一碳源并引起培养基pH发生碱性变化这一生化特性而设计的经典试验。通过观察指示剂溴麝香草酚蓝的颜色变化（由绿变蓝为阳性），可以快速获得有价值的鉴定信息。该试验在肠杆菌科细菌，特别是在区分克雷伯菌属与大肠埃希菌、鉴定亚利桑那沙门菌等方面具有重要价值。正确理解其原理、严格规范操作流程、结合其他生化试验结果进行综合分析，是确保该试验在临床微生物鉴定中发挥最大效用的关键。
参考文献：
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