β－半乳糖苷酶试验（ONPG试验）：原理、操作与应用
一、 试验目的与定义
β-半乳糖苷酶试验，又称ONPG试验，是一种微生物生化试验，用于检测细菌是否产生β-半乳糖苷酶。该酶能催化乳糖及其类似物（如邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷，即ONPG）的水解。核心目的在于快速鉴别某些细菌（特别是肠杆菌科细菌）是否具备发酵乳糖的潜在能力，尤其适用于那些发酵缓慢或迟发酵乳糖的菌株。
二、 试验原理
- 底物： 使用人工合成的无色化合物——邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, ONPG） 作为底物。其结构类似于乳糖的半乳糖苷部分。
- 酶的作用： 如果待测细菌产生β-半乳糖苷酶，该酶就能水解ONPG分子中的β-半乳糖苷键。
- 产物与显色： 水解反应产生两个产物：
- 半乳糖
- 邻硝基苯酚（O-nitrophenol）：这是一种黄色化合物，在碱性条件下颜色更加鲜明（离子化状态）。
- 结果判读： 因此，试验混合物出现黄色即表明β-半乳糖苷酶阳性（+）；保持无色则为阴性（-）。
三、 试剂与材料准备
- ONPG溶液 (0.75 - 1.0 M)：
- 将ONPG溶解于0.01 M pH 7.5的磷酸钠缓冲液中。溶解可能需要加热（不超过50℃）或放置过夜。溶液应呈无色或极淡黄色。
- 重要提示： ONPG溶液不稳定，需避光冷藏保存。如出现明显黄色（表明已自发水解），则不可使用。
- 缓冲液： 常用0.01 M pH 7.5的磷酸钠缓冲液（Na2HPO4/NaH2PO4系统）来配制ONPG溶液和/或悬浮细菌。有时也可使用无菌生理盐水悬浮细菌。
- 阳性对照菌株： 如大肠埃希菌（ATCC 25922）。
- 阴性对照菌株： 如普通变形杆菌（ATCC 13315）。
- 其他： 无菌生理盐水、接种环、试管或小瓶、37℃水浴箱或温箱、比色用白卡纸。
四、 操作步骤（试管法）
- 菌悬液制备：
- 挑取18-24小时纯培养的待测菌落（通常来自非选择性或弱选择性培养基，如营养琼脂或麦康凯琼脂），置于约0.5 ml无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液中，制成浓厚菌悬液。
- 加试剂：
- 向菌悬液中加入约0.25 ml ONPG溶液，轻轻混匀。
- 孵育：
- 将试管置于37℃水浴或温箱中孵育。关键：需要定期观察颜色变化（通常每30分钟至1小时观察一次），最长孵育时间一般不超过24小时。
- 观察结果：
- 在孵育过程中或结束时，在白色背景下观察试管内液体颜色变化。
五、 结果判读
- 阳性 (+)： 菌液出现明显的黄色。颜色深浅与酶活性和菌量有关。通常在30分钟至数小时内出现黄色。
- 阴性 (-)： 孵育24小时后，菌液仍然保持无色或与原色（如菌悬液的轻微乳白色）一致。
- 对照：
- 阳性对照：应在数小时内变黄。
- 阴性对照：应保持无色。
- 试剂空白（ONPG溶液加缓冲液）：应保持无色，用于排除试剂自身水解。
六、 质量控制
- 新批次试剂测试： 每批新配制的ONPG溶液必须用已知阳性和阴性菌株进行测试，确保结果符合预期。
- 常规质控： 每次试验或每周试验时，应同时接种阳性对照菌（如大肠埃希菌）和阴性对照菌（如普通变形杆菌）。
- 菌龄控制： 使用18-24小时的新鲜培养物。陈旧培养物酶活性可能下降。
- 观察时机： 对于发酵乳糖缓慢的细菌（如志贺菌属、某些沙门菌属），需及时观察（如2-4小时），因为阳性反应可能在较短时间内出现，但若孵育时间过长（如超过6小时），即使阴性菌也可能因非酶促缓慢水解而出现弱阳性（假阳性）。
七、 临床应用与意义
ONPG试验在临床微生物学中主要用于肠杆菌科细菌的鉴定和鉴别：
- 鉴别乳糖发酵状态：
- 快速乳糖发酵菌（如大肠埃希菌、克雷伯菌属、肠杆菌属）： 通常ONPG试验阳性。它们具有组成型或诱导型β-半乳糖苷酶，能快速发酵乳糖。
- 迟发酵或不发酵乳糖菌：
- ONPG阳性： 表明该菌具有β-半乳糖苷酶，但可能缺乏将葡萄糖转运入细胞的渗透酶（透性酶），或渗透酶功能缺陷/诱导缓慢。这类菌通常能发酵乳糖但速度很慢（迟发酵），如柠檬酸杆菌属、哈夫尼亚菌属、沙雷菌属、某些普罗威登斯菌以及亚利桑那沙门菌（现归类为沙门菌亚种IIIa）。
- ONPG阴性： 表明该菌缺乏β-半乳糖苷酶，通常不能发酵乳糖，如志贺菌属、沙门菌属（除亚利桑那菌外）、普通变形杆菌、摩根菌属、耶尔森菌属等。
- 辅助鉴定关键菌群：
- 鉴别志贺菌与迟发酵乳糖大肠埃希菌（非典型大肠）：志贺菌ONPG通常阴性，而某些不活跃或迟发酵乳糖的大肠埃希菌ONPG阳性。
- 鉴别沙门菌属与亚利桑那沙门菌（沙门菌亚种IIIa）：大多数沙门菌ONPG阴性，亚利桑那沙门菌ONPG阳性。
- 鉴别普通变形杆菌（ONPG阴性）与奇异变形杆菌（ONPG阳性）：两者在吲哚试验上也有区别（普变吲哚+，奇变吲哚-）。
八、 优点
- 快速： 对于具有β-半乳糖苷酶的迟发酵菌，阳性结果通常在数小时（2-4小时）内出现，远快于在含乳糖培养基中观察到产酸（可能需要24-48小时）。
- 特异性高： 直接检测目标酶的存在。
- 操作相对简单。
九、 局限性
- 非唯一决定因素： 阳性仅表明有β-半乳糖苷酶，不保证一定有完整的乳糖发酵能力（还需渗透酶）。阴性表明缺乏该酶，通常不能发酵乳糖。
- 观察时间敏感： 对于阴性菌，过长时间孵育可能导致假阳性（非酶促缓慢水解）。
- 试剂稳定性： ONPG溶液需妥善保存，变质后不可用。
- 不能替代传统糖发酵试验： 是传统乳糖发酵试验的重要补充，尤其在鉴别迟发酵菌时，但不能完全替代在含乳糖培养基上的最终观察。
十、 关键注意事项
- 菌龄： 必须使用新鲜培养物（18-24小时）。陈旧培养物酶活性可能丧失。
- ONPG溶液质量： 使用前检查颜色，明显变黄则废弃。避光冷藏保存。
- 孵育时间： 严格遵循推荐的孵育和观察时间窗（通常不超过24小时，对于阴性预期菌种建议观察不超过6小时）。 长时间孵育会增加假阳性风险。
- 结果判读： 在白色背景下观察，对比试剂空白或阴性对照。弱阳性（淡黄色）也应判读为阳性。
- 菌悬液浓度： 菌悬液应足够浓厚以保证足够酶量。
- 温度控制： 确保孵育温度恒定在37℃。
- 结合其他试验： ONPG试验结果必须结合细菌的菌落形态、革兰染色、氧化酶试验和其他生化试验结果（如TSI、MIU、IMViC等）进行综合判断。
总结：
ONPG试验是临床微生物实验室鉴定肠杆菌科细菌，特别是区分快速、迟发酵和不发酵乳糖菌株的一项关键生化试验。它通过检测β-半乳糖苷酶的存在，弥补了传统乳糖发酵试验在时效性上的不足，对于准确鉴别志贺菌属、沙门菌属及其类似菌（如柠檬酸杆菌属、哈夫尼亚菌属等）具有重要价值。严格遵循操作规程和质量控制要求是获得可靠结果的前提。