糖（醇、苷）类发酵试验

糖（醇、苷）类发酵试验详解：微生物鉴定的基石

一、 基本原理

糖（醇、苷）类发酵试验是微生物学鉴定中应用最广泛的基础生化试验之一，其核心原理在于检测微生物利用特定碳水化合物（单糖如葡萄糖、双糖如乳糖、多糖如淀粉、醇类如甘露醇、糖苷类如水杨苷等）作为碳源和能源的能力。

微生物在代谢碳水化合物时会经历以下主要途径：

1. 发酵（Fermentation）：在无氧或兼性厌氧条件下，微生物通过糖酵解（EMP途径等）将碳水化合物分解为丙酮酸，进而产生各种酸性终末产物（如乳酸、乙酸、甲酸、琥珀酸等）和/或气体（如二氧化碳、氢气）。
2. 氧化（Oxidation）：某些严格需氧或兼性需氧菌在有氧条件下，通过需氧呼吸将碳水化合物彻底氧化分解为二氧化碳和水，过程中也常产生酸性中间产物。
3. 不利用（No Utilization）：微生物缺乏分解该种碳水化合物必需的酶系，无法利用其作为碳源。

本试验主要检测：

• 产酸（Acid Production）：微生物代谢碳水化合物产生酸性物质，导致培养基pH值下降。
• 产气（Gas Production）：微生物在发酵过程中产生气体（主要是CO₂和H₂）。

二、 试验材料与方法

1. 培养基（基础配方示例 - 无企业信息）：

   • 基础成分： 蛋白胨、氯化钠、指示剂（常用酚红、溴甲酚紫或溴麝香草酚蓝）、待测碳水化合物（如1%浓度）、蒸馏水。
   • 特殊要求：
     • 产气检测： 需使用带有倒置小发酵管（杜氏小管/Durham tube）的试管或专用发酵管，用于捕获产生的气体。
     • 氧化发酵（O/F）试验： 使用含低浓度蛋白胨（0.2%）的基础培养基（如Hugh-Leifson培养基），并设置开放管（覆盖薄层无菌矿物油以隔绝空气）和封闭管（不覆盖油）进行对比接种，以区分细菌是氧化型（仅在开放管产酸）、发酵型（封闭管和开放管均产酸）还是不利用型（两管均不产酸）。

2. 操作步骤：

   • 培养基制备： 按配方称量干粉（或使用标准配方自行配制），加入蒸馏水溶解，调节pH至所需值（通常7.2-7.4）。分装至含倒置小管的试管中，高压灭菌（115°C，10-15分钟）。待测碳水化合物需单独过滤除菌或配成高浓度溶液灭菌后，在无菌条件下加入已灭菌冷却的基础培养基中（避免高温破坏糖类）。
   • 接种：
     • 用无菌操作技术挑取待测菌的纯培养物（通常为18-24小时的幼龄菌），穿刺接种（适用于半固体或含倒管液体）或接种于液体培养基中。严格避免杂菌污染。
     • 对于氧化发酵（O/F）试验，需同时接种两支培养基（一支开放管，一支封闭管）。
   • 培养： 将接种后的培养基置于适宜该微生物生长的温度（通常35-37°C）下培养一定时间（通常18-24小时至48小时，某些慢生长菌或特殊试验需更长时间）。培养过程中避免剧烈摇晃以防气体逸出。
   • 观察与判读（关键步骤）：
     • 产酸判读： 观察培养基中指示剂的颜色变化。常用指示剂变色范围：
       • 酚红（Phenol Red）: 碱性（红） -> 酸性（黄）。应用最广。
       • 溴甲酚紫（Bromocresol Purple）: 碱性（紫） -> 酸性（黄）。
       • 溴麝香草酚蓝（Bromothymol Blue）: 碱性（蓝） -> 酸性（黄）。
     • 产气判读： 观察倒置小发酵管或培养基中是否有气泡聚集。小管顶部出现明显气泡（通常占据小管体积的10%或以上）判为产气阳性（+）。仅培养基变浑浊或颜色改变但小管无气泡为产气阴性（-）。气体量少时需轻轻敲击试管观察气泡是否移动。
     • 氧化发酵（O/F）判读：
       • 发酵型（Fermenter, F）: 开放管和封闭管均变黄（产酸）。
       • 氧化型（Oxidizer, O）: 仅开放管变黄，封闭管不变色或呈蓝色（碱性）。
       • 不利用型（Neither, N）: 开放管和封闭管均不变色（通常保持绿色或紫色）或仅呈微弱碱性（由于蛋白胨分解）。
     • 记录： 详细记录每种待测碳水化合物是否产酸（+/-）和是否产气（+/-），或O/F试验结果（F/O/N）。

三、 结果判读与意义

• 试验结果表示：

  • 阳性（+）：培养基颜色由指示剂碱性色变为酸性色（产酸），和/或倒置小管中有明显气泡（产气）。
  • 阴性（-）：培养基颜色无变化或呈碱性（不产酸），且倒置小管中无气泡（不产气）。
  • 常用符号：A (Acid, 产酸)， G (Gas, 产气)， AG (产酸产气)， - (阴性)。
  • O/F试验结果：F (发酵型)， O (氧化型)， N (不利用型)。

• 微生物鉴定意义：

  • 核心鉴定特征： 不同种属的微生物具有特定的碳水化合物发酵谱（Carbohydrate Fermentation Profile）。这是微生物（尤其是肠杆菌科、非发酵革兰阴性杆菌、链球菌属、酵母菌等）鉴定分型的关键依据之一。
  • 举例：
    • 大肠埃希菌（Escherichia coli）: 典型发酵多种糖类（如葡萄糖、乳糖），产酸产气（AG）。乳糖发酵阳性是其重要特征。
    • 伤寒沙门菌（Salmonella Typhi）: 葡萄糖发酵产酸产气（AG），但不发酵乳糖和蔗糖（-）。
    • 志贺菌属（Shigella spp.）: 葡萄糖发酵产酸不产气（A），不发酵乳糖（-）或迟缓发酵（>48小时）。
    • 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）: O/F试验为氧化型（O），氧化葡萄糖产酸，但不发酵乳糖等。
    • 粪肠球菌（Enterococcus faecalis）: 发酵多种糖类（如甘露醇、山梨醇）。
    • 白色念珠菌（Candida albicans）: 能发酵葡萄糖和麦芽糖（产酸产气），通常不发酵乳糖。

四、 应用领域

1. 临床微生物学实验室：
   • 肠道致病菌（沙门菌、志贺菌、致病性大肠杆菌、耶尔森菌等）的初步鉴定与分型。
   • 非发酵革兰阴性杆菌（如假单胞菌、不动杆菌、产碱杆菌等）的鉴别。
   • 革兰阳性球菌（如链球菌、肠球菌）的鉴别。
   • 酵母菌（如念珠菌属）的鉴定。
2. 食品与环境卫生微生物学： 检测食品、水源中的指示菌（如大肠菌群、粪大肠菌群）和特定病原菌。
3. 工业微生物学与基础研究： 筛选具有特定发酵能力的菌株，研究微生物的代谢途径和生理特性。

五、 注意事项与局限性

1. 无菌操作： 整个试验过程必须严格遵守无菌操作规程，防止污染导致假阳性或假阴性。
2. 纯培养： 务必使用待测菌的纯培养物接种，混合培养结果不可靠。
3. 培养基质量：
   • 碳水化合物必须准确添加且未分解。
   • 指示剂灵敏度需保证。
   • pH值需准确。
   • 倒置小管必须在灭菌前放入且腔内无气泡残留。
4. 培养条件： 温度、时间、需氧/厌氧环境须严格控制，符合目标微生物的生长特性。培养时间不足可能导致假阴性（如迟缓发酵菌）。
5. 结果判读：
   • 及时观察判读（通常在18-24小时和48小时），避免过度培养导致的逆转现象（细菌利用酸性产物使pH回升）。
   • 产气量少时需仔细辨别。
   • 碱性产物干扰：某些微生物分解蛋白胨产生碱性产物（如胺类），可能导致培养基变碱（指示剂呈蓝色/紫色），掩盖了微弱的产酸反应。使用低蛋白胨基础的O/F培养基可减少干扰。
   • 解读需结合其他试验： 单一糖发酵试验结果不足以准确鉴定菌种，必须结合革兰染色、形态学、其他生化试验（如IMViC、尿素酶、氧化酶、凝固酶等）和血清学试验进行综合判断。
6. 自动化与标准化： 传统手工方法耗时长，工作量大。现代临床实验室广泛使用商品化的自动化或半自动化鉴定系统（如API、VITEK、MicroScan等），这些系统通常包含预置的多种糖（醇、苷）发酵微孔，配合比色或产气检测技术，能快速（4-24小时）得出全面的生化谱结果。

总结：

糖（醇、苷）类发酵试验是微生物学实验室不可或缺的基本功。它通过检测微生物分解特定碳水化合物产生酸和气体的能力，为微生物（特别是细菌和酵母）的鉴定提供关键的生化依据。理解其原理、掌握标准化的操作流程、准确判读结果并认识到其局限性，对于微生物的准确鉴定和分类至关重要。虽然现代自动化系统提高了效率，但掌握传统方法的精髓依然是微生物学工作者的重要基础。