甘油复红甲基红（MR）试验

甘油复红与甲基红（MR）试验详解：微生物代谢能力的检测

引言

在微生物鉴定领域，特别是细菌鉴定中，检测细菌对不同碳源的代谢能力及其产生的终产物至关重要。甘油复红试验和甲基红（MR）试验是两项经典的生化试验，它们分别聚焦于细菌对甘油和葡萄糖的代谢途径及其产物的鉴定。这两项试验在区分肠道杆菌科成员（如大肠埃希菌和产气肠杆菌）方面具有重要价值。本文将深入探讨这两项试验的原理、步骤、结果解读及其应用。

一、 甲基红（MR）试验

1. 目的： 检测细菌发酵葡萄糖时是否产生并积累大量稳定的酸性终产物（主要是混合酸，如乙酸、乳酸、甲酸、琥珀酸等）。

2. 原理：

   • 细菌在含有葡萄糖的蛋白胨水培养基中生长。
   • 某些细菌（如大肠埃希菌）具有混合酸发酵途径。它们发酵葡萄糖产生多种有机酸（如乳酸、乙酸、甲酸、琥珀酸），导致培养基的pH值显著且稳定地下降（通常低于4.4）。
   • 甲基红是一种pH指示剂：
     • pH ≤ 4.4 时显红色（阳性反应）。
     • pH ≥ 6.2 时显黄色（阴性反应）。
     • pH在4.5-6.1之间显橙色（过渡色，视为阴性或需延长培养）。
   • 因此，加入甲基红指示剂后，颜色变红表明培养基呈强酸性，意味着细菌产生了大量稳定的酸性终产物。

3. 培养基： MR-VP培养基（葡萄糖蛋白胨水培养基）。配方通常包含蛋白胨（提供氮源）、葡萄糖（提供碳源）、磷酸氢二钾（缓冲剂）、蒸馏水。pH调至约6.9。

4. 试剂： 甲基红指示剂溶液（通常0.02%或0.04%甲醇或乙醇溶液）。

5. 操作步骤：

   1. 将纯培养的待测细菌接种于MR-VP培养基中。
   2. 35-37°C需氧培养 48±2小时（培养时间至关重要）。
   3. 取出培养物，加入几滴（通常5-6滴）甲基红指示剂。
   4. 轻轻摇匀，立即观察颜色变化。

6. 结果判定：

   • 阳性 (+)： 培养物上层呈现鲜红色或深红色（表明pH≤4.4，产生大量稳定酸）。
   • 阴性 (-)： 培养物呈现黄色（表明pH≥6.2，未产生大量稳定酸，可能产生中性产物如乙酰甲基甲醇）。
   • 可疑： 呈现橙色（pH在4.5-6.1之间）。可能原因包括接种量不足、培养时间不够或菌种特性。应延长培养至4-5天或重新试验。

7. 质量控制：

   • 阳性对照：大肠埃希菌 (ATCC 25922) - 应呈阳性（红色）。
   • 阴性对照：产气肠杆菌 / 阴沟肠杆菌 - 应呈阴性（黄色）。
   • 培养基/试剂对照：未接种的MR-VP培养基加指示剂 - 应呈淡琥珀色/黄色（阴性）。

二、 甘油复红试验

1. 目的： 检测细菌是否能利用甘油作为唯一碳源和能源生长，并在此过程中还原复红染料（使其褪色）。

2. 原理：

   • 培养基中含有甘油作为唯一可发酵碳源、蛋白胨作为氮源以及碱性复红染料（品红）。
   • 某些细菌具有还原酶系统（通常与无氧条件下的甘油代谢有关），能够还原碱性复红染料中的发色基团。
   • 还原后的染料分子结构改变，失去其红色，导致培养基褪色（变为无色或淡黄色）。
   • 因此，培养基褪色表明细菌能够代谢甘油并在此过程中还原复红染料。

3. 培养基： 专用的甘油复红肉汤（有时称品红肉汤）。基础成分包括牛肉膏、蛋白胨、甘油和碱性复红（品红）。配制好的培养基呈深红色或紫红色。

4. 操作步骤：

   1. 将纯培养的待测细菌接种于甘油复红肉汤中。
   2. 35-37°C需氧培养（某些标准要求严格厌氧培养，具体需遵循实验室规程），通常观察7至10天（因为褪色过程可能较慢）。
   3. 每天观察培养基颜色变化。

5. 结果判定：

   • 阳性 (+)： 培养基完全褪色（无色或淡黄色/淡粉色），表明甘油被利用且复红被还原。
   • 阴性 (-)： 培养基保持原有红色或紫红色，或仅在试管底部有轻微的褪色环/沉淀（通常视为阴性），表明甘油未被利用或复红未被有效还原。
   • 注意： 有时培养基可能出现部分褪色或浑浊，需与未接种管对比。

6. 质量控制：

   • 阳性对照：沙门菌属某些种（如伤寒沙门菌 - 需厌氧培养时阳性率高）或特定变形杆菌菌株 - 应呈阳性（褪色）。
   • 阴性对照：大肠埃希菌 (ATCC 25922) - 应呈阴性（保持红色）。
   • 培养基对照：未接种的甘油复红肉汤 - 应保持深红色/紫红色。

三、 两项试验的应用与意义

1. 区分肠杆菌科细菌： 这两项试验（尤其是MR试验）常用于区分大肠埃希菌（MR+, 甘油复红-）与其近缘的产气肠杆菌/阴沟肠杆菌（MR-, 甘油复红+）。是经典IMViC试验的重要组成部分（I:吲哚试验，M: MR试验，Vi: VP试验，C: 枸橼酸盐利用试验）。
2. 鉴定其他细菌：
   • MR试验阳性菌： 大肠杆菌、志贺菌属、沙门菌属（多数）、变形杆菌属（多数）、耶尔森菌属（多数）。
   • MR试验阴性菌： 产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、粘质沙雷菌。
   • 甘油复红阳性菌： 沙门菌属（尤其伤寒沙门菌）、某些变形杆菌（如普通变形杆菌）、柠檬酸杆菌属某些种（在厌氧条件下）。阴性结果更常见于肠杆菌科多数成员。
3. 反映代谢途径：
   • MR阳性 (+) 反映了菌株具有混合酸发酵途径。
   • MR阴性 (-) 反映了菌株倾向于丁二醇发酵途径（产生中性终产物）。
   • 甘油复红阳性 (+) 反映了菌株具有还原酶系统并能利用甘油作为碳源进行生长（通常与厌氧代谢关联更强）。

四、 注意事项

1. 培养时间： MR试验对培养时间极其敏感，必须严格遵守48±2小时。过短可能导致假阴性（酸未积累足够），过长（如5天后）即使产酸菌也可能因代谢掉酸性产物导致假阴性。甘油复红试验需较长时间（7-10天）观察褪色。
2. 接种量： 接种量应适中且标准化，确保有充足菌体生长。
3. 试剂添加： MR指示剂需在培养后加入，且加入后需立即观察结果，避免颜色随时间变化。
4. 培养条件： 甘油复红试验的需氧/厌氧要求可能因实验室标准或特定菌株而异，务必遵循操作规程。厌氧培养通常能提高阳性率。
5. 培养基质量： 使用质量合格的脱水培养基粉或按标准配方准确配制，确保葡萄糖（MR）、甘油（甘油复红）浓度准确。葡萄糖在高压灭菌过程中可能降解，应遵循制造商灭菌建议或采用过滤除菌。
6. 结果判读： MR试验颜色判定需清晰明确（红 vs 黄），橙色为可疑。甘油复红褪色应明显且完全。
7. 结合其他试验： 单一试验结果不足以准确鉴定细菌种类，必须结合菌落形态、革兰染色、氧化酶试验及其他生化试验（如IMViC全套、TSI、尿素酶等）进行综合分析。

结论

甘油复红试验和甲基红（MR）试验是微生物学实验室中检验细菌对甘油和葡萄糖代谢能力的重要生化工具。它们基于不同的原理——甘油复红试验检测甘油代谢相关的染料还原能力，而MR试验检测葡萄糖发酵途径中稳定酸性产物的积累。理解这两项试验的原理、规范的操作步骤、准确的判读标准以及它们的应用价值，对于正确鉴定细菌，特别是在区分肠杆菌科成员方面至关重要。严格遵守试验条件（特别是MR试验的培养时间、甘油复红试验的观察时长和可能的厌氧要求）和进行必要的质量控制是获得可靠的微生物鉴定结果的关键保障。这两项经典试验至今仍是细菌鉴定流程中不可或缺的一环。