胆汁七叶苷水解试验

发布时间：2025-06-20 10:18:16 阅读量：2 作者：生物检测中心
  •  
  •  
  •  
  1.  
  2.  
  3.  
  4.  

胆汁七叶苷水解试验：原理、操作与应用

胆汁七叶苷水解试验（Bile Esculin Hydrolysis Test）是临床微生物学实验室中一项经典的生化鉴定试验，主要用于鉴定肠球菌属（Enterococcus spp.）细菌以及与其他链球菌（特别是D群链球菌中的非肠球菌）进行区分，是肠球菌鉴定流程中的关键步骤之一。

一、 试验原理

该试验基于细菌在含有胆汁的环境下分解七叶苷（Esculin）的能力。

  1. 胆汁耐受性： 培养基中加入较高浓度的胆汁盐（通常为40%）。胆汁能抑制许多不能耐受胆盐的细菌生长。肠球菌和某些D群链球菌能够在含胆汁的环境中生长。
  2. 七叶苷水解： 目标细菌若能产生一种胞外酶——七叶苷水解酶（β-葡萄糖苷酶），则可将七叶苷分解为葡萄糖和七叶素（Esculetin）。
  3. 显色反应： 培养基中含有柠檬酸铁铵作为指示剂。水解产生的七叶素能与培养基中的铁离子（Fe³⁺）结合，形成一种稳定的、水溶性的黑色酚铁络合物，导致整个培养基斜面的颜色从浅黄色/琥珀色变为棕褐色至黑色。

二、 培养基

  • 常用培养基： 胆汁七叶苷琼脂（Bile Esculin Agar）斜面或胆汁七叶苷液体培养基（较少用）。
  • 核心成分：
    • 基础营养物（如心浸液、蛋白胨）：提供细菌生长所需营养。
    • 牛胆盐（Oxgall）或其他等效胆汁盐： 浓度通常为40%（w/v）。这是试验的核心选择因子，用于抑制非耐受菌。
    • 七叶苷： 作为底物，浓度通常为0.1%（w/v）。
    • 柠檬酸铁铵： 作为铁离子来源和显色指示剂，浓度通常为0.05%（w/v）。
    • 琼脂（用于斜面培养基）。

三、 试验操作步骤

  1. 培养基准备： 使用灭菌的胆汁七叶苷琼脂斜面培养基。

  2. 接种： 用接种针挑取待测菌的纯培养菌落，在斜面上划一条较长的直线（通常占斜面长度的1/2到2/3）。如果是胆汁七叶苷液体培养基，则需穿刺接种。

  3. 培养： 将接种后的培养基置于35-37°C恒温培养箱中，在需氧环境下培养。观察时间通常为18-24小时，如果24小时结果为阴性或可疑，可延长培养至48小时再观察一次（肠球菌通常在24小时内呈现明显阳性）。

  4. 结果观察与判读：

    • 阳性结果： 培养基斜面（围绕接种线的区域或整个培养基）变为棕褐色至深黑色（通常超过斜面面积的50%变为黑色即可判读为阳性）。这表明细菌能在胆汁存在下生长并水解七叶苷形成黑色络合物。
    • 阴性结果： 培养基斜面**保持原有颜色（浅黄色/琥珀色）**或仅有接种线处菌苔生长，但无明显的黑色变化。这可能是两种情况：
      • 细菌不能在胆汁中生长（被抑制）。
      • 细菌能在胆汁中生长但缺乏七叶苷水解酶，不能水解七叶苷产生七叶素进行显色反应。

四、 结果判读注意事项

  • 判读时间： 24小时是标准判读时间。阳性结果通常在18-24小时内出现明显的黑色。延迟判读（48小时）有时可能出现假阳性或弱阳性，需结合其他试验综合判断。
  • 颜色变化范围： 黑色变化应覆盖接种线周围相当面积（通常>50%斜面），轻微的褐色或不均匀变化应视为阴性或可疑，需重复试验。接种线本身变黑（但斜面不变色）通常不能判为阳性。
  • 生长情况： 阴性结果需确认是否有细菌生长。如果完全没有生长，说明细菌被胆汁抑制，结果为阴性（无法水解七叶苷）。如果有生长但不变色，也是阴性（能耐受胆汁但无水解酶）。

五、 主要应用与意义

  1. 鉴定肠球菌属： 肠球菌属细菌（如粪肠球菌 E. faecalis、屎肠球菌 E. faecium）胆汁七叶苷水解试验为阳性（+）。这是鉴定肠球菌的关键特征之一（通常与6.5% NaCl耐受试验、吡咯烷酮芳基酰胺酶PYR试验结合使用）。
  2. 区分链球菌：
    • D群链球菌鉴定： 传统意义上的D群链球菌包括肠球菌属和非肠球菌D群链球菌（如牛链球菌 S. bovis 组）。肠球菌和非肠球菌D群链球菌（如牛链球菌组）通常胆汁七叶苷试验阳性。
    • 与其他链球菌区分： B群链球菌（无乳链球菌 S. agalactiae）、A群链球菌（化脓链球菌 S. pyogenes）、肺炎链球菌（S. pneumoniae）以及草绿色链球菌群的绝大多数菌种胆汁七叶苷试验均为阴性（-）。
  3. 与其他革兰阳性球菌的鉴别： 有助于区分肠球菌与某些气球菌属（Aerococcus）、乳球菌属（Lactococcus）等形态相似的细菌，这些菌通常为阴性。

六、 局限性

  1. 非肠球菌D群链球菌阳性： 该试验阳性并不能绝对确定为肠球菌属，因为非肠球菌的D群链球菌（如牛链球菌组）也呈阳性。需要结合其他试验（如PYR、6.5% NaCl耐受、45°C生长）才能可靠区分肠球菌属与非肠球菌D群链球菌。
  2. 罕见例外： 有极个别报道某些非常见细菌可能出现阳性反应，但这在常规临床分离株中极其罕见。
  3. 假阴性/假阳性风险： 操作不当（接种菌量不足、培养时间不足、培养基配制或保存不当）可能导致假阴性。延长培养时间（>48小时）可能导致弱阳性或假阳性。

七、 总结

胆汁七叶苷水解试验是一种操作简便、成本较低且结果相对快速的鉴定试验。它在临床微生物实验室中主要用于：

  • 初步筛选和鉴定肠球菌属细菌。
  • 区分传统的D群链球菌（阳性）与非D群链球菌（如A、B群，肺炎链球菌，草绿色链球菌，阴性）。

作为鉴定流程中的一个重要环节，其结果需要结合菌落形态、革兰染色、触酶试验以及其他生化反应（如PYR、6.5% NaCl、CAMP、Optochin、胆汁溶菌等）或自动化/分子方法进行综合判断，才能实现对细菌的准确鉴定。该试验在血流感染、尿路感染等临床样本病原菌的快速鉴别诊断中具有重要价值。

参考文献：

  1. Murray, P. R., Rosenthal, K. S., & Pfaller, M. A. (2021). Medical Microbiology (9th ed.). Elsevier.
  2. Jorgensen, J. H., Pfaller, M. A., Carroll, K. C., Funke, G., Landry, M. L., Richter, S. S., & Warnock, D. W. (Eds.). (2015). Manual of Clinical Microbiology (11th ed.). ASM Press.
  3. Winn, W., Allen, S., Janda, W., Koneman, E., Procop, G., Schreckenberger, P., & Woods, G. (2006). Koneman's Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology (6th ed.). Lippincott Williams & Wilkins.
  4. Facklam, R. R., & Elliott, J. A. (1995). Identification, classification, and clinical relevance of catalase-negative, gram-positive cocci, excluding the streptococci and enterococci. Clinical Microbiology Reviews, 8(4), 479–495.