干酪乳杆菌检测：方法与应用
一、 干酪乳杆菌简介
干酪乳杆菌是一种革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、不形成芽孢的杆状细菌，通常呈短杆或长杆状，有时呈链状排列。它属于乳酸菌大类，是人和动物肠道、口腔以及多种发酵食品（如奶酪、酸奶、泡菜、发酵香肠）中常见的共生菌或益生菌。
干酪乳杆菌因其诸多有益特性而受到广泛关注：
- 益生功能： 被认为有助于维持肠道菌群平衡，抑制有害菌生长，增强宿主免疫力，可能缓解腹泻、便秘、乳糖不耐受等症状。
- 食品安全与发酵： 广泛用于发酵食品生产，贡献独特风味、质地，并通过产酸（主要是乳酸）和细菌素抑制腐败菌和致病菌生长，延长食品保质期。
- 潜在健康益处： 相关研究涉及其在降低胆固醇、抗高血压、抗过敏、抗肿瘤等方面的潜在作用。
准确检测和鉴定干酪乳杆菌对于评估其在不同环境（尤其是食品、药品和益生菌制剂）中的活性、丰度、安全性以及验证其宣称的功效至关重要。
二、 检测目的与意义
对干酪乳杆菌进行检测的主要目的包括：
- 质量监控： 确保发酵食品（如酸奶、奶酪、益生菌饮料）和益生菌制品中含有足量、具有活性的特定干酪乳杆菌菌株，符合产品标签声称和法规要求。
- 安全评估： 验证产品中是否存在目标干酪乳杆菌，并排除可能的污染菌（如致病菌、腐败菌）。
- 功效研究： 在体外实验、动物模型或人体临床试验中，追踪目标菌株在肠道等部位的定植、存活情况和数量变化，评估其益生效果。
- 菌种鉴定与多样性分析： 对分离株进行准确鉴定，区分干酪乳杆菌与其他相似乳酸菌（如植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌等），或在复杂微生物群落（如肠道菌群、发酵剂）中分析其组成。
- 生产过程控制： 监控发酵过程中干酪乳杆菌的生长动态，优化工艺参数。
- 法规符合性： 满足国内外食品、药品监管机构对益生菌产品标识和质控的要求。
三、 主要检测方法
干酪乳杆菌的检测方法主要分为两大类：基于培养的传统方法和基于分子生物学的现代快速方法。
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传统培养计数法
- 原理： 利用干酪乳杆菌的营养需求和生长特性，提供适宜的选择性培养基和培养条件（如厌氧或微需氧环境），使样品中的活菌生长形成可见菌落，通过计数菌落数来定量。
- 关键步骤：
- 样品处理： 根据样品类型（固体、液体、粉末）进行均质化、稀释。
- 选择性培养： 使用针对乳酸菌或特定干酪乳杆菌的选择性/鉴别性培养基。常用培养基如：MRS培养基（Man Rogosa Sharpe，基础培养基）、添加了特定抗生素或抑制剂（如万古霉素）的MRS-V培养基（抑制部分革兰氏阳性菌）、LC培养基或其他改良培养基。有时利用干酪乳杆菌对特定糖源的发酵能力（如菊糖发酵）进行初步鉴别。
- 培养条件： 通常在37°C下厌氧或微需氧（如使用厌氧罐或带催化剂的密封袋）培养48-72小时。
- 菌落计数： 统计平板上形成的典型菌落数（如圆形、凸起、白色或乳白色、边缘光滑），计算每克或每毫升样品中的活菌数（CFU/g 或 CFU/mL）。
- 初步鉴定： 观察菌落形态、进行革兰氏染色镜检（应为革兰氏阳性杆菌）、过氧化氢酶试验（应为阴性）。
- 优点： 是活菌计数的“金标准”，直观，成本相对较低。
- 缺点： 耗时长（通常需要3-5天），工作量大。选择性培养基有时不能完全抑制杂菌，或可能抑制部分目标菌株，导致假阳性或假阴性。需要后续鉴定确认是否为干酪乳杆菌及特定菌株。
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分子生物学检测法
- 原理： 通过检测干酪乳杆菌特定的DNA或RNA序列（如保守的16S rRNA基因、23S rRNA基因、物种特异性基因片段或菌株特有基因）来进行定性和定量分析。
- 常用技术：
- 聚合酶链式反应： 利用特异性引物扩增干酪乳杆菌的靶基因片段。根据目的不同可分为：
- 常规PCR： 用于快速、特异性地定性检测样品中是否存在干酪乳杆菌DNA。结果通过凝胶电泳观察条带。
- 实时荧光定量PCR： 在PCR反应体系中加入荧光染料或探针，实时监测扩增过程。通过标准曲线或相对定量方法，精确定量样品中干酪乳杆菌特定基因的拷贝数（通常代表细胞数量，严格来说需考虑死/活菌及基因组拷贝数）。这是定量检测的主流分子方法，灵敏度高，特异性强，速度快（通常数小时内完成）。
- 多重PCR： 在同一反应中同时扩增多个乳酸菌种的特异性基因，用于快速鉴别。
- 变性梯度凝胶电泳/温度梯度凝胶电泳： 适用于分析复杂样品（如粪便、发酵剂）中微生物群落结构，通过比较16S rRNA基因V3区等片段的条带模式，可初步判定干酪乳杆菌的存在及其相对丰度变化。通常需结合测序确认。
- 基因测序： 对扩增出的特定基因片段（如16S rRNA基因全序列或部分序列）进行测序，将序列与数据库比对，可进行精确的物种鉴定（种水平）甚至区分相近种。下一代测序技术更可用于分析菌群中所有微生物的组成。
- DNA微阵列： 可同时检测大量目标基因或菌种，用于高通量筛查和鉴定。
- 聚合酶链式反应： 利用特异性引物扩增干酪乳杆菌的靶基因片段。根据目的不同可分为：
- 优点： 特异性高、灵敏度高、快速（尤其qPCR）、可区分死/活菌（若结合活细胞预处理如EMA/PMA）、可实现高通量自动化、可精确鉴定到种甚至株水平。
- 缺点： 设备投入和试剂成本较高，操作人员需专业培训，DNA提取效率可能影响结果，常规PCR和qPCR针对特定基因无法区分死菌DNA（除非使用预处理方法），测序方法通常用于定性或相对定量，复杂基质可能抑制PCR反应。
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其他方法
- 免疫学方法： 如酶联免疫吸附测定法、免疫荧光法。利用干酪乳杆菌特异性抗体进行检测。较少用于常规检测，可能在快速筛查或特定研究中应用。
- 流式细胞术结合荧光染色： 利用特异性荧光探针（如肽核酸探针）标记目标细菌，结合流式细胞仪进行快速计数和分选。具有快速、可定量的潜力，但开发特异性探针是关键挑战。
四、 检测流程概要（以培养结合分子鉴定为例）
- 样品采集与保存： 无菌操作，低温快速运送，尽快检测或按要求保存（如冷冻或添加保护剂）。
- 样品前处理： 均质、稀释（必要时）。
- 分离培养（活菌计数）：
- 选择合适的选择性培养基。
- 涂布或倾注平板。
- 置于适宜温度（通常37°C）厌氧培养48-72小时。
- 菌落观察与计数： 记录典型菌落形态特征，计数。
- 纯培养物获取： 挑取疑似菌落划线纯化培养。
- 初步表型鉴定：
- 革兰氏染色镜检（应为G+杆菌）。
- 过氧化氢酶试验（应为阴性）。
- （可选）碳水化合物发酵试验（API 50 CHL或其他系统）。
- 分子生物学确认（种/株水平鉴定）：
- DNA提取： 从纯培养物中提取基因组DNA。
- PCR扩增： 使用针对干酪乳杆菌种特异性基因（如特定16S rRNA片段、recA基因、pheS基因等）或菌株特异的引物进行PCR。常用方法如种特异性PCR或随机扩增多态性DNA分析。
- 结果分析：
- 常规PCR：凝胶电泳观察预期大小条带。
- （更精确）基因测序：扩增特定基因片段（如16S rRNA, hsp60, 多位点序列分析位点），测序后与数据库比对（如GenBank, EzBioCloud等）。
- 结果报告： 包含检测方法、检测结果（活菌数CFU/g或CFU/mL，或是否检出特定DNA）、鉴定结果（如经鉴定为干酪乳杆菌XX菌株）。
五、 方法选择与注意事项
- 目的决定方法： 活菌计数必须用培养法（或流式等计数活细胞的方法）。定性检测或定量检测死/活菌总量、种/株特异性鉴定、高通量分析等首选分子方法（特别是qPCR和测序）。
- 样品基质： 复杂样品（如粪便、土壤）对DNA提取效率和PCR抑制效应影响大，需优化处理方法或使用专门试剂盒。
- 特异性与灵敏度： 确保引物/探针对干酪乳杆菌（甚至特定菌株）的高度特异性。qPCR的灵敏度通常远高于培养法。
- 定量准确性： qPCR定量需建立可靠的标准曲线（如使用基因组DNA标准品），并考虑样品中可能存在的抑制物影响扩增效率。
- 死/活菌区分： 常规分子方法无法区分死菌DNA。若需检测活性菌，培养法仍是金标准；分子方法可结合叠氮溴化乙锭或碘化丙啶等染料预处理样品，选择性抑制死菌DNA的扩增。
- 标准化与质控： 严格遵循标准操作程序，设置阴性对照（无模板）、阳性对照（已知目标菌DNA或菌悬液）和环境对照（检测实验过程污染）至关重要。定期验证方法的特异性和灵敏度。
- 结果解读： 分子方法检测到特定DNA片段，表明该遗传物质存在，但不一定代表有活性的完整细胞。培养法计数的是可培养的活菌，可能低估实际数量。
六、 应用场景
- 食品工业： 发酵乳制品（酸奶、奶酪、发酵乳饮料）、益生菌食品、泡菜、发酵肉制品等的产品质控（活菌数达标、目标菌株存在）、发酵过程监控、货架期评估。
- 益生菌行业： 益生菌制剂（粉剂、胶囊、片剂）的活菌含量测定、菌株纯度与身份鉴定、稳定性研究。
- 药品与保健品： 含活菌药品的质量控制（符合药典要求）。
- 临床与基础研究： 评估益生菌干预后目标菌株在粪便或肠道内容物中的定植情况、菌群结构分析、功效机制研究。
- 环境监测： 特定环境中乳酸菌分布的调查研究。
七、 结语
干酪乳杆菌的检测技术已从传统的培养方法发展为以分子生物学技术为主导的多元化检测体系。培养法在活菌计数上仍是不可或缺的基础，而基于PCR（特别是实时荧光定量PCR）和基因测序的方法凭借其快速、灵敏、特异和高通量的优势，在物种鉴定、特异性检测和精确定量方面发挥着核心作用。正确选择和组合应用这些方法，并严格进行实验室质量控制，是确保干酪乳杆菌检测结果准确、可靠、满足不同应用场景需求的关键。随着技术的不断发展（如数字PCR、第三代测序、微流控芯片等），干酪乳杆菌的检测将朝着更灵敏、更快速、更智能、更高通量的方向演进。