乳酸肠球菌检测

发布时间：2025-06-20 09:28:43 阅读量：2 作者：生物检测中心
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乳酸肠球菌检测：方法、意义与应用指南

一、乳酸肠球菌概述

乳酸肠球菌（Enterococcus lactis）是肠球菌属（Enterococcus）中的一个重要种。与其他肠球菌类似，它具备以下典型特征：

  • 革兰氏阳性球菌：通常成对或短链状排列。
  • 兼性厌氧：能在有氧和无氧环境下生长。
  • 耐受力强：对胆盐、高盐（6.5% NaCl）和一定范围的温度（10-45℃）及pH值具有较强耐受性。
  • 代谢特性：能发酵多种糖类产酸（主要是乳酸），过氧化氢酶通常阴性。

乳酸肠球菌常见于乳制品（如生奶、奶酪、发酵乳制品）、植物性发酵食品以及动物肠道环境中。与一些致病性较强的肠球菌（如粪肠球菌、屎肠球菌）相比，乳酸肠球菌被认为具有较低的致病潜力，并且在发酵工业中展现出作为益生菌或发酵剂的潜力。

二、检测乳酸肠球菌的意义

对乳酸肠球菌进行检测在多个领域具有重要意义：

  1. 食品安全与质量控制：

    • 发酵食品生产： 监控发酵过程中乳酸肠球菌作为启动培养物或天然菌群的存在与活力，确保产品质量稳定性和风味特征的形成。
    • 原料监控： 检测原料奶、植物原料等中乳酸肠球菌的水平，评估原料新鲜度和潜在污染物。
    • 终产品安全： 确保终产品中不存在致病性肠球菌，并监控乳酸肠球菌作为指示菌或目标菌的数量是否符合标准。

  2. 益生菌研究与产品开发：

    • 菌种筛选与鉴定： 准确鉴定分离自环境或样品的菌株是否为乳酸肠球菌，筛选具有优良益生特性的菌株（如耐酸胆盐、黏附性、产抗菌物质等）。
    • 产品质控： 确保益生菌产品中标注的乳酸肠球菌菌株的存在、活性及数量达标。

  3. 微生物生态研究： 了解特定环境（如肠道、食品发酵系统、自然环境）中乳酸肠球菌的分布、丰度及与其他微生物的相互作用。

  4. 风险评估： 尽管致病性较低，仍需对其分离株进行必要的安全性评估（如是否存在特定毒力基因、抗生素耐药性等）。

三、乳酸肠球菌的主要检测方法

检测流程通常包括样品处理、增菌/分离培养、疑似菌落鉴定（表型或基因型）以及定量（如需要）。

  1. 样品采集与处理：

    • 根据检测目的（如食品、饲料、环境拭子、粪便样本等），遵循无菌操作规范采集代表性样品。
    • 样品需进行适当的均质化或稀释（常用无菌生理盐水或缓冲蛋白胨水），制备成均匀的初始悬液。

  2. 分离与培养：

    • 选择性增菌 (可选)：对于样品中预期菌量较低或背景菌复杂的情况，可使用选择性增菌肉汤（如含叠氮化钠和碳水化合物的肠球菌肉汤）。
    • 选择性平板分离： 将样品原液或增菌液接种到选择性琼脂平板上。常用培养基包括：
      • KF链球菌琼脂 (KFDA)： 含有叠氮化钠、TTC（指示剂），肠球菌形成红色或粉红色菌落。
      • 胆汁七叶苷叠氮钠琼脂 (mEnterococcus Agar)： 肠球菌能水解七叶苷产生黑色晕圈（源于七叶苷与铁离子反应），并在叠氮钠存在下生长。
      • 肠球菌显色琼脂： 利用酶底物显色原理，乳酸肠球菌通常呈现特定的颜色（如蓝绿色）。该培养基选择性和特异性较好。
    • 培养条件： 通常在35-37°C，需氧培养24-48小时。

  3. 疑似菌落鉴定： 挑取选择性平板上典型的疑似乳酸肠球菌菌落（根据所用培养基特征判断）进行纯化培养后，进行系统鉴定：

    • A. 表型鉴定法：
      • 形态学观察： 革兰氏染色镜检（应为阳性球菌，成对或短链）。
      • 基础生化试验：
        • 过氧化氢酶试验： 绝大多数肠球菌（包括乳酸肠球菌）应为阴性（不产生气泡）。
        • 胆汁七叶苷试验： 阳性（黑色沉淀/晕圈）。
        • 6.5% NaCl生长试验： 阳性（能在高盐肉汤中生长）。
        • PYR水解试验 (吡咯烷酮芳基酰胺酶)： 阳性（红色）。
        • 关键糖醇发酵试验： 利用商品化生化鉴定条带或自行设计的试验，检测对特定糖（如甘露醇、山梨醇、蔗糖、蜜二糖、棉子糖、阿拉伯糖等）的发酵能力。乳酸肠球菌的典型发酵谱是其重要鉴定依据（如通常发酵甘露醇，不发酵阿拉伯糖）。
      • 自动化生化鉴定系统： 基于微量生化反应的商业系统可快速提供鉴定结果，但仍需结合菌种数据库的准确性。
    • B. 分子生物学鉴定法 (高特异性与准确性)：
      • 16S rRNA基因测序： 将纯菌落提取DNA，PCR扩增16S rRNA基因片段并进行测序。将测序结果与公共数据库（如GenBank）进行比对，是鉴定到种水平的可靠方法。乳酸肠球菌有其独特的16S序列特征。
      • 种特异性PCR： 设计针对乳酸肠球菌特异性基因（如ddl基因或其特定片段、管家基因等）的引物。通过PCR扩增，若获得预期大小的特异性条带，可快速鉴定为目标菌种。这种方法速度快、特异性强，尤其适用于大量样品的筛查或快速确认。
      • 实时荧光定量PCR (qPCR)： 结合特异性引物和探针，不仅可用于定性鉴定，还可对样品中乳酸肠球菌的核酸进行精确定量（需注意区分死菌活菌）。
      • 基因芯片或高通量测序： 适用于复杂样本中微生物群落分析，可同时检测乳酸肠球菌的存在及其相对丰度。

  4. 定量检测：

    • 平板计数法： 最常用且标准化的方法。将稀释的样品液涂布或倾注到选择性琼脂平板上（如KF琼脂、胆汁七叶苷叠氮钠琼脂），培养后计数特征性菌落（CFU/g或CFU/mL）。结果报告需注明培养基名称。此法检测的是可培养活菌数。
    • MPN法 (最可能数法)： 适用于预期菌量很低或样品不均质的检测。将样品稀释液接种到一系列选择性液体培养基管中，根据阳性管数查表估算浓度范围。
    • qPCR定量： 可直接对样品中乳酸肠球菌的DNA（或RNA，指示活菌）进行绝对定量，速度快，但需建立标准曲线且结果受样品基质抑制效应影响，结果表示为基因组拷贝数，需谨慎解释与活菌数的关系。

四、检测关键点与质量控制

  1. 培养基质量控制： 使用前需测试培养基的选择性和特异性（生长率、抑制率）。
  2. 标准菌株对照： 每次检测应包含已知的乳酸肠球菌标准菌株（如ATCC 19435）作为阳性对照，以及其他相关菌株（如粪肠球菌、屎肠球菌、无害的乳球菌等）作为阴性对照。
  3. 样品代表性及均匀性： 确保取样和处理过程能真实反映整体样品情况。
  4. 鉴定准确性： 表型鉴定可能存在交叉反应（与其他肠球菌或乳球菌），分子鉴定是更可靠的金标准。必要时结合多种方法。
  5. 区分同属菌种： 重点区分乳酸肠球菌与常见的粪肠球菌、屎肠球菌以及其他肠球菌种（如耐久肠球菌）。糖发酵谱和分子方法是关键。
  6. 结果解释： 平板计数结果需结合培养基特征描述的典型菌落形态进行报告；分子检测结果需明确是核酸存在而非必然代表活菌。

五、应用实例

  • 乳品厂发酵剂监控： 定期对发酵剂或发酵过程中的样品进行乳酸肠球菌计数及纯度鉴定（排除污染致病性肠球菌或其他杂菌），确保发酵性能和产品安全。
  • 益生菌胶囊质量检测： 对市售益生菌产品进行乳酸肠球菌含量检测（平板计数法），验证其标示活菌数是否达标，并利用特异性PCR确认菌种。
  • 传统发酵食品研究： 从泡菜、豆豉等发酵食品中分离乳酸肠球菌，通过16S测序准确鉴定菌种，研究其群落演替及功能。

六、结语

乳酸肠球菌检测是食品工业、益生菌研发和质量控制、微生物研究等领域的关键技术。检测方法的选择取决于检测目的（定性/定量、快速/准确）、样本类型和可用资源。传统培养结合生化鉴定仍是基础，而基于分子生物学（如特异性PCR、16S测序）的方法因其高特异性和准确性，正变得越来越重要。无论采用何种方法，严格的质量控制、标准化的操作流程以及对结果的准确解读是确保检测结果可靠有效的基石。随着研究的深入和技术的进步，乳酸肠球菌检测方法将不断优化，为其安全有效地应用提供更坚实的保障。

参考文献 (示例格式)：

  1. 国际标准化组织. 食品和动物饲料微生物学 - 肠球菌水平计数的水平方法 - 第1部分：在44℃使用胆汁七叶苷叠氮钠琼脂的菌落计数技术 (ISO 7899-1).
  2. 食品和药品管理局 (某国). 《食品微生物检验手册》- 肠球菌检测章节.
  3. Sedláček I, et al. Enterococcus lactis sp. nov., from animal sources. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2014.
  4. Ben Braïek O, Smaoui S. Enterococcus spp.: Is It a Bad Choice for a Good Use? A Conundrum to Solve? Microorganisms. 2021. (讨论肠球菌的双面性).
  5. 某微生物鉴定系统操作手册 (省略具体品牌).