屎肠球菌检测：方法、意义与应用指南

引言屎肠球菌（Enterococcus faecium）是肠球菌属的一种革兰氏阳性条件致病菌，广泛存在于自然环境和动物及人类肠道中。其检测在临床医学、食品安全、水质监测及环境卫生领域具有重要意义。准确识别和定量屎肠球菌是评估感染风险、监控抗菌药物耐药性及判断环境卫生状况的关键环节。

一、检测意义

临床诊断： 屎肠球菌是医院获得性感染（如尿路感染、菌血症、心内膜炎、手术部位感染）的常见病原体之一，尤其在免疫力低下患者中危害显著。
耐药性监测： 屎肠球菌（尤其是耐万古霉素屎肠球菌 - VREfm）是多重耐药菌的重要代表，其检测对指导临床用药和防控院内感染传播至关重要。
食品安全与水质卫生指示菌：
- 在食品工业中，屎肠球菌可作为加工过程卫生状况和粪便污染的指示微生物（常与粪肠球菌一同评估）。
- 在环境水体（地表水、饮用水源水、娱乐用水、废水）监测中，肠球菌（包含屎肠球菌）是国际上公认的粪便污染指示菌，用于评估水质卫生安全（如美国EPA标准、欧盟指令）。

二、主要检测方法

检测通常包括分离培养、鉴定确认和定量计数（如需要）等步骤。

(一) 传统培养与生化鉴定法（金标准参考方法）

样品前处理：
- 临床样本（血液、尿液、伤口分泌物等）： 通常直接或增菌后接种。
- 食品/环境样本（水、食品、饲料、拭子等）： 需进行适当的均质化、稀释（定量检测时）或过滤浓缩（如水样）。
选择性分离培养：
- 将样本接种于含叠氮化钠的选择性培养基（如KF链球菌琼脂、肠球菌选择性琼脂等）。这类培养基能抑制多数革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌生长。
- 屎肠球菌在此类培养基上形成特征性菌落（通常为直径1-2mm的红色、粉红色或棕褐色圆形菌落，具体颜色取决于培养基指示剂）。
- 典型培养条件：35-37°C，需氧培养24-48小时。
初步筛查与纯化：
- 挑取疑似菌落进行纯培养（如血琼脂平板）。
- 进行革兰氏染色镜检（应为革兰氏阳性球菌，成对或短链状排列）。
- 触酶试验（肠球菌属触酶阴性，可与葡萄球菌区分）。
生化鉴定确认：
- 传统方法需进行一系列生化试验组合：
  - 胆汁七叶苷试验： 绝大多数肠球菌阳性（能在含40%胆汁的培养基中水解七叶苷变黑）。
  - 吡咯烷酮芳基酰胺酶试验： 屎肠球菌通常为阳性（PYR+）。
  - 碳水化合物发酵试验： 关键鉴别试验。
    - 阿拉伯糖发酵： 屎肠球菌通常能发酵阿拉伯糖产酸（阳性）。
    - 山梨醇发酵： 屎肠球菌通常不能发酵山梨醇（阴性）。
  - 动力与产色素： 屎肠球菌无动力，通常不产色素。
- 商品化鉴定系统： 使用市售的微型化、自动化或半自动化生化鉴定试剂盒/系统（如API系列、VITEK系统等原理的产品），简化流程并提高准确性。

(二) 分子生物学方法（快速、特异）

聚合酶链式反应：
- 常规PCR： 设计特异性引物扩增屎肠球菌的靶基因片段（如ddl基因、16S rRNA基因、sodA基因的特异区域）。扩增产物通过凝胶电泳检测特定大小条带确认。
- 实时荧光定量PCR： 在PCR扩增过程中实时监测荧光信号，能同时进行定性检测和绝对定量（需标准曲线），灵敏度高，速度快（数小时出结果）。常用靶基因同上。
- 多重PCR： 可设计多对引物，在一次反应中同时检测屎肠球菌和其他相关微生物（如粪肠球菌、耐药基因等）。
核酸杂交： 使用标记的屎肠球菌特异性核酸探针与样本中的靶DNA/RNA结合进行检测（如FISH技术），特异性强。

(三) 免疫学方法

利用屎肠球菌特异性抗原（如表面蛋白）制备抗体，通过酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试验等进行检测。速度较快，但灵敏度和特异性有时不如分子方法，临床应用较少。

(四) 质谱鉴定技术（MALDI-TOF MS）

对分离纯化的单个菌落进行快速蛋白质谱分析，通过与数据库比对实现种水平的快速（几分钟）准确鉴定。已成为临床微生物实验室肠球菌鉴定的首选方法之一，需昂贵的仪器设备。

(五) 定量方法（主要用于环境与食品）

最可能数法： 适用于样品中细菌数量较低或存在抑制物的情况（如部分食品、污泥）。将样品接种于液体选择培养基（如叠氮化钠葡萄糖肉汤）进行系列稀释和培养，根据阳性管数查MPN表估算浓度。
滤膜法： 常用水质检测。将定量水样通过滤膜过滤，将滤膜贴于选择性琼脂平板（如mEI琼脂）上培养，计数典型菌落数，计算单位体积菌落形成单位。
平板计数法： 适用于细菌数量较高的样品（如部分食品、粪便）。将稀释后的样品涂布或倾注于选择性琼脂平板，培养计数典型菌落。

三、特殊检测需求

耐万古霉素屎肠球菌检测：
- 表型法： 使用含万古霉素（通常6μg/ml）的脑心浸液琼脂或MH琼脂进行筛选培养，能在其上生长的分离株初步判定为VRE。需进一步确认耐药机制（如vanA, vanB基因型）。
- 分子法： PCR检测万古霉素耐药基因（vanA, vanB等）是确认VRE和区分基因型的金标准。
高致病性克隆（如ST17, ST78）鉴定： 通常需要多位点序列分型或全基因组测序分析。

四、检测标准与规范

临床微生物学： 遵循通用的微生物检验操作规程，参考CLSI（临床和实验室标准协会）等相关指南进行药敏试验和结果解释。
食品安全： 遵循国际（如ISO 7899-2:2000 水质 - 肠球菌的检测和计数 - 第2部分：液体介质中膜过滤法）或国家/地区标准（如GB 4789食品微生物学检验相关标准）。
水质监测： 各国/地区有特定标准方法（如美国EPA Method 1600，用于娱乐用水；EPA Method 1106.1用于废水；GB/T 5750生活饮用水标准检验方法的相关章节）。

五、结果解释与局限性

阳性结果意义： 需结合样本来源判断。在无菌部位（如血液）检出具有高度临床意义；在粪便或环境样品中检出，提示粪便污染或其存在。
阴性结果意义： 不能完全排除感染或污染（可能与样本采集时机、运输储存条件、抗生素使用、检测方法灵敏度有关）。
方法局限性：
- 培养法耗时长（24-72小时），依赖生化反应准确性，无法检测不可培养状态或受抑制的细菌。
- 分子法快速灵敏，但无法区分死菌活菌，且对实验污染敏感，成本较高。
- 质谱法依赖数据库完整性和菌落纯度。