各类多糖含量测定 - 中析研究所生物检测中心

各类多糖含量测定方法详解

多糖是广泛存在于自然界中的一类重要生物大分子，在食品、医药、保健品和工业材料等领域具有广泛应用。准确测定多糖含量是科研、生产和质量控制中的关键环节。以下是常用的多糖含量测定方法及其原理与操作步骤：

一、经典方法：苯酚-硫酸法 (Phenol-Sulfuric Acid Method)

原理： 多糖在浓硫酸作用下水解为单糖，并迅速脱水生成糠醛或其衍生物，这些产物与苯酚反应生成橙黄色化合物，在特定波长（通常490 nm）有特征吸收峰，其吸光度与多糖浓度呈线性关系。
适用范围： 广泛适用于各类中性糖（如葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖等）组成的总多糖测定，灵敏度高，是最常用的方法之一。
操作步骤：
1. 标准曲线制备： 精密称取葡萄糖标准品（或其他目标单糖标准品），配制成系列浓度梯度溶液（如0、10、20、30、40、50 µg/mL）。吸取各浓度标准液1.0 mL于具塞试管中。
2. 样品处理： 吸取待测样品溶液（含糖量在标准曲线范围内）1.0 mL于另一具塞试管中。设置空白管（1.0 mL水）。
3. 加显色剂： 向各管中迅速加入5%苯酚水溶液1.0 mL，混匀。
4. 加酸反应： 迅速加入浓硫酸5.0 mL（注意安全！缓慢沿管壁加入，立即振荡混匀）。
5. 显色反应： 将试管置沸水浴中加热15-20分钟（或室温放置30分钟以上，具体时间需优化以保证显色完全），溶液呈橙黄色。
6. 冷却： 取出试管，迅速置于冰水浴中冷却至室温。
7. 比色测定： 于490 nm波长处，以空白管调零，测定标准管和样品管的吸光度（A）。
8. 计算： 以标准品浓度（µg/mL）为横坐标（X），吸光度（A）为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得到线性回归方程（Y = aX + b）。将样品液的吸光度代入方程，计算样品液中相当于标准品的糖浓度（C，µg/mL）。样品多糖含量可按以下公式计算：多糖含量 (%) = (C * V * D * F * 100%) / (10^6 * W)
  - C：样品液测得的糖浓度 (µg/mL)
  - V：样品液总体积 (mL)
  - D：样品液稀释倍数
  - F：换算因子（将单糖换算为多糖的系数，常为0.9，即假设多糖由葡萄糖组成且水解完全）
  - W：样品称样量 (g)
  - 10^6：将µg转换为g的倍数（1 g = 10^6 µg）
优点： 操作相对简单、灵敏度高、显色稳定、重现性好。
缺点： 受硫酸、苯酚浓度、温度、反应时间影响较大；对含蛋白质或色素的样品干扰较大（需去蛋白、脱色预处理）；不同单糖显色强度略有差异（标准品选择应尽量接近样品主要单糖）。

二、3,5-二硝基水杨酸法 (DNS法， Dinitrosalicylic Acid Method)

原理： 在碱性条件下，还原糖（多糖需先酸水解为还原糖）将3,5-二硝基水杨酸（DNS）中的硝基还原为氨基，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸化合物，在540 nm左右有最大吸收，其吸光度与还原糖含量成正比。
适用范围： 主要用于测定还原糖，需先将多糖水解为还原糖再测定。常用于酶活力测定（如淀粉酶、纤维素酶）及水解后多糖总量的测定。
操作步骤：
1. 样品水解（多糖测定）： 多糖样品需先用适当的酸（如2M HCl）在沸水浴中水解一定时间，中和后定容。
2. 标准曲线制备： 配制还原糖标准溶液梯度（如0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL葡萄糖）。
3. 加样： 取标准液、样品水解液、空白（水）各1.0 mL于试管中。
4. 加DNS试剂： 加入1.0 mL DNS试剂（含DNS、NaOH、酒石酸钾钠等）。
5. 显色反应： 沸水浴加热5分钟。
6. 冷却： 流动水冷却至室温。
7. 稀释定容： 加入蒸馏水定容至10 mL（或其他合适体积）。
8. 比色测定： 540 nm波长处测定吸光度。
9. 计算： 同苯酚硫酸法，绘制标准曲线并计算样品还原糖浓度，再乘以水解产生的还原糖相当于原多糖的换算因子（F）。
优点： 操作相对简便、试剂稳定、显色快。
缺点： 主要测定还原糖，需额外水解步骤；灵敏度略低于苯酚硫酸法；某些还原性物质（如维生素C）产生干扰。

三、蒽酮-硫酸法 (Anthrone-Sulfuric Acid Method)

原理： 多糖在浓硫酸作用下脱水生成糠醛衍生物，后者与蒽酮试剂反应生成蓝绿色化合物，在620-630 nm有最大吸收。
适用范围： 对己糖（如葡萄糖、甘露糖、半乳糖）反应灵敏，对戊糖（如阿拉伯糖、木糖）反应较弱，对酮糖（如果糖）反应更弱。适用于总糖或含己糖为主的多糖测定。
操作步骤： 与苯酚硫酸法类似。不同点在于使用蒽酮试剂（蒽酮溶于稀硫酸或乙酸乙酯中），反应后显蓝绿色，在620-630 nm测定。
优点： 对己糖灵敏度高，颜色稳定。
缺点： 显色受温度、酸浓度影响大；蒽酮溶解度有限且不稳定（需新鲜配制或低温避光保存）；专一性不如苯酚硫酸法（对不同糖显色差异大）；干扰物质多。

四、其他方法概述

酶法 (Enzymatic Methods):
- 利用高度特异性的酶（如葡萄糖氧化酶-过氧化物酶/GOD-POD）只催化特定单糖（如葡萄糖）反应，通过测定反应产物（如显色物）间接定量糖。将多糖用特异性酶（如淀粉酶、纤维素酶）水解后，再用单糖酶测定。
- 优点： 特异性极高，灵敏度高，干扰少（尤其适合复杂样品）。
- 缺点： 成本高，操作复杂（需多步酶解），只能测定特定类型的糖（如只测葡萄糖含量）。
高效液相色谱法 (HPLC):
- 将多糖样品完全酸水解为单糖，利用HPLC（常配备示差折光检测器/RID或蒸发光散射检测器/ELSD）分离并定量各单糖组分。通过计算各单糖含量之和得到总糖含量。
- 优点： 可同时准确测定各单糖组成和含量，提供更全面的信息。
- 缺点： 仪器昂贵，操作复杂，耗时长，需要标准单糖进行定性和定量分析。
高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法 (HPAEC-PAD):
- 该方法无需衍生化即可直接分离和检测单糖、寡糖甚至部分多糖。PAD检测器对糖类具有高灵敏度和选择性。
- 优点： 灵敏度高、选择性好、无需衍生化、可分析复杂糖混合物。
- 缺点： 仪器非常昂贵，操作复杂，对实验条件和操作者要求高。

五、方法选择与注意事项

依据目的选择：
- 快速测定总糖含量（通用）：苯酚硫酸法（首选）、蒽酮硫酸法。
- 测定还原糖含量或酶解产物：DNS法。
- 测定特异性单糖含量（如葡萄糖）：酶法。
- 分析单糖组成及精确含量：HPLC、HPAEC-PAD。
样品前处理至关重要：
- 去除干扰物质： 如色素（可用活性炭脱色）、蛋白质（Sevag法、三氯乙酸沉淀法、酶解法等）、脂类（有机溶剂提取）、小分子糖（透析）。
- 多糖的提取与纯化： 确保测定的是目标多糖组分。
- 多糖水解（如果需要）： 酸水解条件（酸浓度、温度、时间）需优化以确保水解完全且不发生过度降解。
标准品选择： 应尽量选用与待测多糖主要单糖组成一致的纯品（如葡萄糖、葡聚糖）绘制标准曲线。否则需使用换算因子F进行校正。
严格控制实验条件： 显色反应对温度、时间、试剂添加速度和均匀性非常敏感，务必保持操作一致。
平行实验与空白对照： 样品和标准品均应做平行实验，并设置相应的试剂空白。
换算因子F： 这是一个经验值（通常0.8-0.9），反映单糖聚合形成多糖后分子量的变化。最准确的方法是测定待测多糖的真实分子量和单糖组成来计算理论F值，或通过与已知含量的标准多糖比较确定。

总结：

苯酚硫酸法因其简便性、灵敏度和通用性，仍是实验室测定多糖总含量的最常用方法。DNS法适用于还原糖或水解后多糖的测定。蒽酮法对己糖灵敏。酶法、HPLC和HPAEC-PAD则提供了更高的特异性或更全面的组成信息，但成本或复杂性也更高。选择哪种方法取决于测试目的、样品性质、设备条件和精度要求。精密、规范的操作和充分的样品前处理是获得准确可靠数据的关键。