谷光甘酞过氧化酶检测

发布时间：2025-06-19 16:15:06 阅读量：14 作者：生物检测中心

谷胱甘肽过氧化物酶检测：原理、方法与应用

一、引言

谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase, GPx， EC 1.11.1.9）是生物体内重要的抗氧化酶之一，尤其在清除活性氧（ROS）和脂质过氧化物、维持细胞氧化还原平衡中起着核心作用。GPx以谷胱甘肽（GSH）为还原底物，催化过氧化氢（H₂O₂）或有机氢过氧化物（ROOH）还原为水和相应的醇，同时将GSH氧化为其二聚体（GSSG）。检测GPx活性对于评估生物体的抗氧化能力、研究氧化应激相关疾病（如心血管疾病、神经退行性疾病、糖尿病、衰老、癌症等）的发病机制及药物筛选具有重要意义。

二、检测原理（以经典DTNB比色法为例）

目前应用最广泛的检测原理是基于GPx催化反应后再生还原型谷胱甘肽（GSH）的偶联反应系统（也称为“间接法”或“酶偶联法”）。其核心步骤如下：

  1. GPx催化反应：

    ROOH + 2GSH → ROH + H₂O + GSSG

    GPx催化氢过氧化物（ROOH，常用叔丁基过氧化氢或H₂O₂）被GSH还原，产生氧化型谷胱甘肽（GSSG）和水（或醇）。

  2. GSSG再生为GSH：

    GSSG + NADPH + H⁺ → 2GSH + NADP⁺

    反应体系中加入谷胱甘肽还原酶（GR）和还原型辅酶Ⅱ（NADPH）。GR利用NADPH作为电子供体，将GSSG迅速还原回2分子GSH，同时NADPH被氧化为NADP⁺。

  3. NADPH消耗的监测： NADPH在340 nm波长处有特征性吸收峰。随着GPx催化反应的持续进行，NADPH不断被消耗，导致其在340 nm处的吸光度（OD₃₄₀）随时间线性下降。通过测定单位时间内OD₃₄₀的下降速率（ΔOD₃₄₀/min），即可反映GPx催化的反应速率，进而计算其酶活性（单位：U/mg蛋白或U/mL样本等）。

  4. 偶联反应总体系：

    ROOH + 2GSH → (GPx催化) → ROH + H₂O + GSSG GSSG + NADPH + H⁺ → (GR催化) → 2GSH + NADP⁺ ----------------------------------------------- 总反应： ROOH + NADPH + H⁺ → ROH + H₂O + NADP⁺

    可见，每消耗1分子ROOH，必然伴随消耗1分子NADPH。

三、主要检测方法

  1. 分光光度法（DTNB比色法）: 如上所述，通过监测340 nm处NADPH吸光度的下降来测定GPx活性。这是目前最常用、标准化程度高、成本相对较低的方法。适用于各种样本（血浆、血清、红细胞裂解液、组织匀浆、细胞提取液等）。
  2. 荧光法: 利用特定荧光探针（如DCFH-DA）被活性氧氧化后荧光增强的原理，间接反映GPx清除过氧化物的能力。或利用还原型谷胱甘肽与荧光染料（如邻苯二甲醛，OPA）反应生成荧光产物来检测GSH消耗量。灵敏度高，但干扰因素也较多。
  3. 化学发光法: 利用某些化学发光反应（如鲁米诺-过氧化物酶-HRP体系）对H₂O₂的敏感性，通过测量发光强度变化来评估GPx对底物过氧化物的清除能力。灵敏度极高，常用于微量样本或高通量筛选。
  4. 放射性同位素法: 早期曾使用放射性标记的过氧化物底物（如¹⁴C-过氧化氢十八碳四烯酸），监测其被还原后放射性产物的生成量。因安全性和便捷性问题，现已较少使用。
  5. 电化学法: 利用电极直接监测反应过程中电流或电势的变化（如基于过氧化物酶修饰电极）。仍在发展阶段，具有潜在的高灵敏度、实时检测优势。

四、实验步骤概要（以DTNB法检测红细胞GPx为例）

  1. 样本制备：
    • 采集抗凝血，离心分离红细胞。
    • 红细胞用冰冷生理盐水洗涤数次。
    • 将压积红细胞用冰冷蒸馏水（或特定裂解液）裂解，离心去除细胞膜碎片，上清即为红细胞溶血液样本（测定血红蛋白浓度，Hb g/dL）。
  2. 试剂配制（示例，具体浓度依方案而定）：
    • 反应混合液： 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）， EDTA， NaN₃（防腐）， GSH， GR。
    • 底物溶液： 叔丁基过氧化氢（t-BuOOH）或H₂O₂（溶于缓冲液）。
    • 启动液： NADPH（溶于缓冲液）。
    • 终止液： 某些方案可能需要。
  3. 操作流程（96孔板或比色杯）：
    • 在反应孔/杯中加入：缓冲液、红细胞溶血液（用缓冲液适当稀释）、反应混合液（含GSH、GR等）。
    • 混匀，预温育至反应温度（通常37℃）。
    • 加入启动液（NADPH）开始反应，迅速混匀。
    • 立即在分光光度计上于340 nm波长处，连续监测吸光度变化（通常3-5分钟），记录线性下降阶段的ΔOD₃₄₀/min。
    • 空白对照： 用蒸馏水或缓冲液代替样本，同样操作。样本对照： 用缓冲液代替底物（t-BuOOH/H₂O₂），同样操作，扣除非酶促消耗。
  4. 结果计算：
    • 计算样本管的净反应速率：ΔOD₃₄₀/min (样本) = ΔOD₃₄₀/min (总) - ΔOD₃₄₀/min (样本对照)。
    • 根据NADPH的摩尔消光系数（ε₃₄₀ = 6.22 × 10³ L mol⁻¹ cm⁻¹）计算酶活性：酶活性 (U/L) = (ΔOD₃₄₀/min * 反应总体积 (mL) * 样品稀释倍数 * 1000) / (ε₃₄₀ * 光径 (cm) * 样品体积 (mL))
    • 常以血红蛋白校正： 酶活性 (U/g Hb) = 酶活性 (U/L) / Hb浓度 (g/dL) * 100（因Hb浓度单位是g/dL，需换算）。也可用样本蛋白浓度校正。

五、影响因素与注意事项

  1. 样本处理： 样本（尤其是血液、组织）需新鲜或-80℃低温保存，避免反复冻融。处理过程需保持低温（冰浴），防止酶失活。溶血会影响红细胞GPx测定。
  2. 试剂稳定性： NADPH、GSH溶液需新鲜配制或分装冻存（-20℃以下），避免氧化失效。GR活性需保证。
  3. 浓度控制： GSH浓度需饱和（远大于Km值），保证反应速率仅与GPx活性和底物浓度有关。底物（ROOH）浓度需在适当范围（线性区间），过高可能导致酶失活。
  4. 干扰因素：
    • 非特异性反应： 样本中可能存在其他消耗NADPH或GSH的物质。设置样本对照（不加底物）至关重要。
    • 血红蛋白： 高浓度血红蛋白在340nm附近有吸收且在反应中可能产生干扰，需充分稀释样本（尤其测血浆/血清时）。测红细胞GPx时需用Hb浓度校正。
    • 胆红素、脂血： 可能影响吸光度读数。
  5. 质量控制：
    • 设置平行复孔。
    • 使用标准品或质控样本监控批内和批间差异。
    • 确保反应速率在监测时间内呈线性（R² > 0.95）。

六、应用领域

  1. 临床医学：
    • 评估机体抗氧化状态和氧化应激水平。
    • 辅助诊断或监测与氧化损伤相关的疾病：动脉粥样硬化、冠心病、心力衰竭、糖尿病（及并发症）、阿尔茨海默病、帕金森病、慢性肾病、肝病、某些癌症等。
    • 评估药物（如抗氧化剂）的疗效。
  2. 营养学研究： 评估膳食成分（如硒、维生素E、C、植物多酚等）对机体抗氧化酶系统的影响。
  3. 环境与毒理学： 评估环境污染物（重金属、农药、有机溶剂等）对生物体的氧化损伤效应。
  4. 基础医学与生物学研究： 研究氧化应激在细胞信号转导、衰老、凋亡、基因表达调控等过程中的作用机制。
  5. 农业与食品科学： 评估农作物抗逆性、果蔬保鲜过程中的氧化状态变化等。

七、总结

谷胱甘肽过氧化物酶检测是评估生物体抗氧化防御能力的关键指标。以NADPH消耗为基础的DTNB分光光度法由于其可靠性、经济性和标准化程度高，成为应用最广泛的方法。精确的检测结果依赖于规范的样本处理、优化的反应条件设置、严格的对照设置以及质量控制的实施。随着对氧化应激在疾病中作用认识的深入，GPx活性的检测在临床诊断、疾病机制研究、药物开发和健康评估等领域的应用将持续拓展。未来，更高灵敏度、特异性、自动化程度和多重检测能力的技术发展将进一步推动该领域的进步。

参考文献（范例格式）

  1. Flohé L, Günzler WA. Assays of glutathione peroxidase. Methods Enzymol. 1984;105:114-21. doi: 10.1016/s0076-6879(84)05015-1.
  2. Paglia DE, Valentine WN. Studies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutathione peroxidase. J Lab Clin Med. 1967 Oct;70(4):158-69.
  3. Lawrence RA, Burk RF. Glutathione peroxidase activity in selenium-deficient rat liver. Biochem Biophys Res Commun. 1976 Aug 9;71(3):952-8. doi: 10.1016/0006-291x(76)90747-6.
  4. Rotruck JT, Pope AL, Ganther HE, et al. Selenium: biochemical role as a component of glutathione peroxidase. Science. 1973 Feb 9;179(4073):588-90. doi: 10.1126/science.179.4073.588.
  5. 中华医学会检验医学分会. 临床生物化学检验常规项目分析质量指标. (国内权威指南/共识，具体名称和年份需查找最新版)。

注意：

  • 实际操作请务必参考具体实验室的标准化操作规程（SOP）。
  • 不同样本类型（血浆/血清、组织、细胞）的前处理方法存在差异。
  • 不同亚型的GPx（如胞浆GPx1、胃肠道GPx2、血浆GPx3、磷脂氢过氧化物GPx4）在组织分布、底物特异性和功能上有所不同，选择检测方法时需考虑目标酶的特性。