口腔产品体外牙菌斑抑制功效评价 - 中析研究所生物检测中心

口腔产品体外牙菌斑抑制功效评价方法综述

牙菌斑生物膜（口腔生物膜）是定植于口腔硬组织表面的复杂微生物群落，是龋病、牙周病等主要口腔疾病发生的始动因子。开发能有效抑制牙菌斑形成及发展的口腔护理产品（如牙膏、漱口水等）至关重要。体外评价模型因其可控性强、周期短、成本相对较低且符合伦理要求，成为筛选和初步验证产品功效的关键环节。本文系统阐述体外牙菌斑抑制功效评价的核心策略与方法。

一、牙菌斑生物膜体外模型的建立

构建能模拟口腔环境的体外模型是评价的基础，主要包括以下要素：

微生物来源与接种：
- 标准菌株： 常选用公认的致龋或致牙周病相关菌株，如变异链球菌、血链球菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌等。可单独使用或组合形成简化群落模型。
- 唾液接种物： 收集健康供体（通常需禁食、清洁口腔后）的无刺激混合唾液，离心去除细胞碎片后，取上清液（含唾液游离细菌和唾液蛋白）作为接种源，更能反映口腔微生物的天然多样性。
- 菌斑样本： 获取临床牙菌斑样本进行分散处理，作为接种物，代表原位群落结构，但个体差异大。
基底（模拟牙面）：
- 羟基磷灰石圆片： 因其化学组成与牙釉质相似，是最常用且公认度高的基底材料。可涂布唾液获得获得性膜。
- 牛牙釉质切片：生物相容性极佳，但来源受限，个体差异大。
- 其他材料：如钛片（模拟种植体）、抛光树脂片、玻璃片等，根据研究目的选择。
培养系统：
- 静态模型： 将基底浸没于含培养基和接种物的容器中（如24孔板、定制反应器）。操作简单，成本低，但缺乏流体剪切力，生物膜结构与生理状态与口腔有差异。
- 动态模型：
  - 恒化器/生物膜反应器： 培养基持续流入，流出废液，维持营养物质恒定和低生长速率，更接近口腔环境。可连接多个基底支架。
  - 流动池系统： 培养基以可控流速持续流过固定于通道内的基底表面，提供剪切力，促进更贴近生理状态的生物膜形成。可在线显微观察。
  - 微流控芯片： 微尺度通道精准模拟流体环境，并可整合多重刺激和原位检测，是前沿发展方向。
- 人工口腔模型： 更为复杂的系统，整合多个牙模、人工唾液持续灌注、温度控制，甚至模拟咀嚼，接近口腔环境，但构建和维护成本高。
培养基与培养条件：
- 培养基： 常用脑心浸液肉汤、胰蛋白酶大豆肉汤，补充蔗糖（尤其致龋研究）、半乳糖、葡萄糖等碳水化合物作为产酸基质，或添加富含唾液的培养基模拟口腔环境（如Mucin Medium）。
- 厌氧环境： 牙菌斑核心区域多为厌氧环境，常需要在厌氧工作站或罐中使用混合气体培养。
- 温度与时间： 通常维持在37°C。培养时间从数小时（初期粘附）到数天（成熟生物膜）不等。

二、评价产品抑制功效的核心方法

产品（或其活性成分提取物）的处理方式多样：直接加入培养基、短期接触基底预成生物膜、模拟漱口后残留环境等。评价指标主要包括：

微生物学评价：
- 平板菌落计数法：
  - 原理： 将生物膜从基底上物理移除（如超声、刮取）并分散均匀，进行连续稀释，涂布于适宜琼脂平板，培养后计数活菌落形成单位。
  - 优点： 直接定量检测可培养的活菌总数。
  - 局限： 仅反映可培养微生物；分散步骤可能影响结果；对成熟厚生物膜效果不佳。
- 荧光染色结合显微镜计数：
  - 原理： 使用荧光染料（如SYTO® 9/碘化丙啶双染、DAPI、SYBR® Green）染色生物膜。共聚焦激光扫描显微镜可分层扫描获取生物膜三维结构信息；荧光显微镜或高通量成像系统可获取二维信息。
  - 指标： 生物膜覆盖面积百分比、平均厚度、生物量、活死菌比例、微菌落结构等。
  - 优点： 直观可视生物膜空间结构，获取活死菌信息。
  - 局限： 设备昂贵；图像分析可能复杂耗时；对荧光染料敏感。
- 荧光染料结合微孔板读数法：
  - 原理： 生物膜形成于微孔板底部，染色（如结晶紫染总生物量，SYTO®染活菌）。溶解染料后，用酶标仪测定吸光度或荧光强度。
  - 优点： 高通量，适合初期大量样品筛选。
  - 局限： 空间信息丢失；结果可能受生物膜结构及染料结合特性影响。
- qPCR/RT-qPCR：
  - 原理： 提取生物膜总DNA或RNA，针对特定菌种或功能基因设计引物探针进行定量检测。
  - 优点： 精确定量特定微生物（包括难培养菌），灵敏度高。
  - 局限： 不易区分死菌活菌（DNA），RT-qPCR可测活菌但更复杂；成本相对高；需预先选定目标基因。
生物化学评价：
- pH值变化（酸生成分析）：
  - 原理： 在含糖培养基中培养生物膜，实时或终点监测培养基pH值下降幅度和速率。
  - 意义： 直接反映生物膜的致龋潜力，产品抑制产酸能力。
- 胞外多糖定量：
  - 原理： 生物膜中的水溶性葡聚糖（溶于水）和水不溶性葡聚糖（溶于碱）是菌斑基质主要成分。常用蒽酮比色法或苯酚硫酸法测定多糖总量。
  - 意义： 反映生物膜粘附性和结构的稳定性。
- 关键酶活性测定： 如检测葡萄糖基转移酶（催化蔗糖合成葡聚糖的关键酶）活性受抑制情况。
物理化学评价：
- 生物膜干重/湿重： 直接称量从基底上刮取的生物膜重量，简单但精度有限。

三、评价模型与方法的挑战与发展

挑战：
- 复杂性模拟不足： 体外模型难以完全模拟口腔的温度波动、唾液流率、咀嚼力、周期性营养供给、复杂的宿主免疫因子及超过700种微生物的复杂互作。
- 个体差异： 基于唾液或菌斑样本的模型受供体影响大。
- 标准化： 模型构建（如基底处理、唾液获得性膜形成、接种物制备）、操作流程（如培养时间、换液频率、剪切力大小）及结果分析方法缺乏全球统一标准，影响结果可比性。
- 静态模型局限性： 缺乏流体作用和物质交换。
发展与趋势：
- 多物种复杂群落模型： 构建更接近自然菌群的合成或简化的多物种群落模型。
- 高通量与自动化技术： 结合机器人、微流控和高内涵成像技术提升筛选效率和通量。
- 多组学技术整合： 结合宏基因组、宏转录组、代谢组学等，在分子水平深入解析产品对微生物群落结构、功能通路和代谢产物的影响。
- 动态模型优化： 发展更精准模拟口腔流体环境的持续培养和灌流系统。
- 原位、实时监测技术： 开发非侵入式传感器监测生物膜代谢活动。

四、结论

体外牙菌斑抑制功效评价是口腔护理产品研发和质量控制的关键环节。选择合适的微生物来源、基底材料、培养系统（尤其是动态模型）以及多维度评价方法（微生物学、生物化学、物理化学指标结合），对于准确、全面地评估产品潜力至关重要。尽管存在模拟口腔环境的复杂性挑战，体外模型因其可控性和效率优势，仍是不可替代的研究工具。未来研究需致力于发展更生理相关、标准化、高通量且整合多组学技术的评价体系，以更精准地预测产品在人体内的实际效果，推动更安全有效的口腔护理产品的开发与应用。

参考文献举例 (格式为GB/T 7714)：

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