金黄色葡萄球菌杀灭（抑制）试验方法与应用
一、 试验目的与分类
- 杀灭试验（杀菌试验）： 评估受试物直接杀死金黄色葡萄球菌的能力，通常以杀菌率或杀灭对数值（Log Reduction）表示。
- 抑制试验（抑菌试验）： 评估受试物抑制金黄色葡萄球菌生长繁殖的能力，通常以最低抑菌浓度（MIC）或抑菌圈直径表示。
二、 核心实验材料与菌株
- 标准菌株： 推荐使用国际公认的标准菌株（如 ATCC 6538, ATCC 29213）。根据研究目的，可增加临床分离株（如 MRSA 菌株）进行测试。
- 培养基：
- 营养肉汤（如 Tryptic Soy Broth, TSB）： 用于菌种活化、增菌培养及液体抑菌试验（MIC）。
- 营养琼脂（如 Tryptic Soy Agar, TSA）、血琼脂： 用于菌株传代、保存、菌落计数及固体抑菌试验（抑菌圈法）。
- 试剂： 无菌生理盐水（0.85-0.9% NaCl）、磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.2-7.4）、必要时使用中和剂（如卵磷脂-吐温80中和剂、硫代硫酸钠等）。
- 主要设备： 恒温培养箱（37°C）、生物安全柜、高压灭菌器、漩涡振荡器、微量移液器及枪头、菌落计数器（或成像系统）、分光光度计（测菌液OD值）。
三、 金黄色葡萄球菌杀灭试验方法（定量悬浮法）
- 培养基质制备：
- 从冻存或斜面挑取典型菌落接种于TSB肉汤，37°C振荡培养18-24小时（对数生长期）。
- 取适量培养物，用PBS或生理盐水离心洗涤（如 3000rpm, 10min），弃上清，重复2-3次，去除残余培养基。
- 用PBS或生理盐水重悬菌体，稀释调整浓度至约 1 × 10⁸ - 5 × 10⁸ CFU/mL（通常对应麦氏浊度0.5左右）。
- 中和剂选择与验证： 选择能有效终止受试物作用且对微生物无毒性的中和剂。必须进行验证试验，证明其在试验条件下能中和受试物并支持微生物复苏。
- 试验操作：
- 将一定体积（如1mL）的已知浓度菌悬液加入装有预定浓度（或体积）受试物的试管中，迅速混匀，立即开始计时（t=0）。
- 设定多个接触时间点（如0.5min, 1min, 5min, 10min, 30min等）。在每一时间点结束时，立即取一定量（如1mL）混合液，加入含足量灭菌中和剂（如9mL）的试管中，充分混匀，终止杀菌作用。
- 对于“0”接触时间组：将菌悬液加入含中和剂的受试物中（或先将菌悬液加入含中和剂的容器，再加入受试物），立即取样稀释计数，作为起始菌量对照。
- 阳性对照组：用无菌生理盐水或PBS代替受试物，与菌悬液混合，在最长接触时间点取样计数。
- 阴性对照组：仅中和剂培养基质，验证无菌。
- 活菌计数：
- 将中和后的混合液进行系列10倍稀释（如10⁻¹, 10⁻², 10⁻³...）。
- 选取适宜稀释度的菌液各1mL或0.1mL，倾注TSA平板（或涂布），每个稀释度做2-3个平行。
- 37°C倒置培养24-48小时。
- 计数菌落形成单位（CFU），计算各稀释度的平均CFU/mL。
- 结果计算与判定：
- 杀菌率（%） = [(阳性对照组平均活菌数 - 试验组平均活菌数) / 阳性对照组平均活菌数] × 100%
- 杀灭对数值 (LR) = Log₁₀(阳性对照组平均活菌数) - Log₁₀(试验组平均活菌数)
- 判定标准（示例）：通常认为杀灭率 ≥ 99.9%（LR ≥ 3）具有良好杀菌效果（具体标准需依据相关行业标准或研究目的设定）。
四、 金黄色葡萄球菌抑制试验方法
- 琼脂扩散法（抑菌圈法，定性/半定量）：
- 制备TSA平板，表面干燥。
- 将新鲜制备的菌悬液（浓度约1×10⁸ CFU/mL）均匀涂布于平板表面。
- 放置灭菌的牛津杯（或打孔）于琼脂表面，轻轻压紧。
- 向杯（孔）内加入一定量（如100μL）的受试溶液或样品提取液。设置溶剂（如无菌水、DMSO等）阴性对照和已知阳性抗生素对照。
- 37°C培养18-24小时。
- 测量抑菌圈（透明圈）直径（mm），包括牛津杯外壁。结果解读： 抑菌圈直径越大，表示抑菌作用越强（需排除溶剂本身的扩散效应）。通常需结合对照和重复实验结果综合判断。
- 肉汤稀释法（定量MIC测定）：
- 用液体培养基（如MH肉汤）对受试物进行一系列倍比稀释（如128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5 µg/mL...），分装于无菌试管或96孔板中。
- 调整菌液浓度至约5×10⁵ CFU/mL。
- 向各浓度药物管/孔中加入等体积调整好的菌悬液，最终菌浓度约5×10⁴ CFU/mL。
- 设无药生长对照（只含菌和培养基）和无菌阴性对照（只含培养基）。
- 37°C培养16-20小时（或适当时间）。
- 结果观察与MIC判定：
- 肉眼观察各管/孔浊度。生长对照应明显浑浊，阴性对照应澄清。
- 最低抑菌浓度（MIC）： 即肉眼观察下，完全抑制金黄色葡萄球菌生长的最低药物浓度（管/孔保持澄清）。
- （可选）可将MIC孔/管内容物转种无药平板培养，测定最低杀菌浓度（MBC）。
五、 质量控制与注意事项
- 菌种纯度与活性： 使用前确认菌株纯度和活性（典型形态、革兰氏染色、凝固酶试验阳性）。
- 菌液浓度准确性： 推荐使用浊度仪结合活菌计数法校准菌液浓度。
- 中和剂有效性： 必须进行中和剂验证试验，确保其能有效中和受试物且不影响微生物恢复生长。
- 接触时间与温度： 严格控制各接触时间点和试验温度（通常37°C）。
- 充分混匀： 菌悬液与受试物、中和剂等接触时需充分混匀，确保作用均匀。
- 平行与重复： 试验设置足够的平行样（通常≥3）并独立重复试验（通常≥2次），确保结果可靠。
- 标准操作与无菌操作： 严格遵循无菌操作规程，防止污染。
六、 结果应用与意义
- 消毒剂评价： 验证其对金黄色葡萄球菌（包括MRSA）的杀灭效果是否符合相关消毒技术规范要求。
- 抗菌材料开发： 评估新型涂层、纺织品、医疗器械材料等对金黄色葡萄球菌的抑制或杀灭能力。
- 天然产物筛选： 从植物、微生物等来源中筛选具有抗金黄色葡萄球菌活性的化合物。
- 药物敏感性试验： 测定临床分离株对各类抗生素的MIC，指导合理用药。
- 机制研究： 结合其他实验技术（如电镜、流式细胞术、分子生物学），探究化合物或材料的抗菌作用机制。
结论： 金黄色葡萄球菌的杀灭与抑制试验是微生物学、医药卫生、材料科学等领域的基础研究和应用评价的重要手段。采用标准化的方法（如定量悬浮法、琼脂扩散法、肉汤稀释法），并严格控制试验条件（菌株、浓度、中和、时间、温度）和进行严格的质量控制，是获得可靠、可比、可重复结果的关键。这些试验结果对于保障公共健康安全、指导感染防控、推动新型抗菌产品的研发与应用具有不可替代的价值。