大肠杆菌杀灭（抑制）试验 - 中析研究所生物检测中心

大肠杆菌杀灭（抑制）试验方法与评价

本研究依据微生物学标准方法，设计严谨试验评估样品对大肠杆菌（Escherichia coli）的杀灭或抑制效果。

利用大肠杆菌（标准菌株ATCC 25922或等效菌株）作为指示微生物，通过定量或定性方法测定待测样品处理后残留菌落数量或抑制区域大小，评价其抗菌效能。

菌悬液制备：
- 挑取大肠杆菌单菌落接种于NB，36±1℃振荡培养18-24小时。
- 取培养液离心，无菌生理盐水洗涤2次，重悬调整浓度至1×10⁸ ~ 5×10⁸ CFU/mL（0.5麦氏单位）。
中和剂验证： 预先确认所选中和剂能有效阻断样品残余活性且对微生物无毒。
试验分组：
- 试验组： 9 mL样品 + 1 mL菌悬液 → 混匀 → 作用至预定时间（T₁, T₂...Tn）。
- 阳性对照组： 9 mL生理盐水 + 1 mL菌悬液 → 混匀 → 作用至预定时间。
- 阴性对照组： 9 mL生理盐水 + 1 mL无菌生理盐水 → 混匀。
- 样品对照： 9 mL样品 + 1 mL无菌生理盐水 → 混匀 → 作用至预定时间。
- 中和剂对照组： 9 mL中和剂 + 1 mL菌悬液 → 混匀 → 作用至预定时间。
中和与培养：
- 作用时间结束后，立即取1 mL混合液加入9 mL含中和剂的培养基中（或按已验证方法中和）。
- 充分混匀，静置10分钟。
- 进行10倍系列稀释（通常至10⁻⁴）。
- 取适宜稀释度液体1 mL或0.1 mL，倾注营养琼脂平板（每个稀释度至少2皿）。
- 36±1℃培养48小时。
菌落计数： 计数平板菌落数（30~300 CFU/皿），计算每毫升原混合液中活菌浓度（CFU/mL）。

菌悬液制备： 同A.1，调整浓度至1×10⁶ ~ 1×10⁷ CFU/mL。
含菌平板制备：
- 取15-20 mL已灭菌冷却至约45℃的营养琼脂，加入1 mL菌悬液，混匀。
- 倾注无菌平皿，待凝。
样品施加：
- 滤纸片法： 将无菌圆形滤纸片（直径约6 mm）浸润样品溶液，沥干后贴于含菌平板表面。
- 打孔法： 用无菌打孔器在含菌平板上打孔（直径约6 mm），去除孔内琼脂，加入定量样品溶液。
- 样品块法： 将待测固体样品制成规定尺寸（如4mm×4mm）方块，直接贴于平板。
培养与测量： 平板正置于36±1℃培养箱中孵育18-24小时。测量样品周围形成的清晰抑菌圈直径（mm），精确至0.1 mm。

计算各组活菌浓度： 阳性对照组活菌浓度记为N₀ (CFU/mL)，试验组各时间点活菌浓度记为Nₜ (CFU/mL)。
计算杀灭率：
- 杀灭率 (%) = [(N₀ - Nₜ) / N₀] × 100%
- 或计算杀灭对数值：Log减少值 = lg N₀ - lg Nₜ
评价标准：
- 通常认为杀灭率 ≥ 99.9%（或Log减少值 ≥ 3.0）具有显著的杀菌效果。
- 具体评价标准需根据试验目的（如消毒、防腐）参照相应行业规范。
对照组要求：
- 阳性对照组应显示正常生长。
- 样品对照组、阴性对照组、中和剂对照组应无菌生长或生长可接受（无明显抑制或促进）。