体外哺乳动物细胞染色体畸变

发布时间：2025-06-19 09:15:49 阅读量：3 作者：生物检测中心
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体外哺乳动物细胞染色体畸变试验：原理、方法与意义

引言

体外哺乳动物细胞染色体畸变试验（In Vitro Mammalian Chromosomal Aberration Test）是遗传毒理学研究体系中至关重要的短期试验（Short-Term Assay）。其主要目的在于检测受试化学物或物理因素是否具备诱发哺乳动物体细胞染色体结构与数目改变的能力，从而评估其潜在的致突变性（Mutagenicity）和遗传危害（Genetic Hazard）。该试验因其敏感性高、周期相对较短、操作可控性强，被广泛应用于化学品、药品、食品添加剂、化妆品原料及环境污染物等的遗传毒性初筛和风险评估。

一、核心原理

在严格控制的体外环境中（如培养皿、培养瓶），将哺乳动物细胞系（如中国仓鼠肺细胞CHL、中国仓鼠卵细胞CHO、人外周血淋巴细胞HPBLs等）暴露于一系列浓度的受试物中。暴露期间或之后，细胞接受特定处理以使其停滞在细胞分裂中期（Metaphase）。通过显微镜观察处于这一时期的细胞染色体形态，识别并计数各类染色体结构的异常改变（畸变）以及可能发生的染色体数目异常（非整倍体或多倍体），从而判断受试物是否具有诱导遗传物质损伤的潜力。

二、试验系统关键要素

  1. 细胞选择：

    • 常用细胞系： CHL、CHO、V79（中国仓鼠肺成纤维细胞）等永生细胞系因其分裂旺盛、核型稳定清晰而被广泛应用。人外周血淋巴细胞（需经有丝分裂原如PHA刺激活化）因其直接来源于人类，具有特殊的相关性价值。
    • 主要优势： 细胞来源稳定、生长可控、背景畸变率相对较低。

  2. 代谢活化系统（S9混合液）：

    • 必要性： 许多化学物质需经生物代谢活化（通常是肝脏中的细胞色素P450酶系统）才能转化为具有遗传毒性的活性形式。单纯的体外系统缺乏这种代谢能力。
    • 模拟方案： 试验中通常设置有代谢活化（+S9） 和无代谢活化（-S9） 两种条件。S9混合液由经酶诱导剂（如Aroclor 1254或苯巴比妥/β-萘黄酮）处理的大鼠肝匀浆上清液（S9组分）与辅助因子（NADPH再生系统）组成，在暴露初期加入，模拟体内代谢过程。

  3. 暴露方案：

    • 浓度设计： 设置多个剂量组（通常至少3个浓度），覆盖从无明显细胞毒性到接近50%细胞抑制（如细胞生长抑制率约50%）的范围。高浓度通常由细胞毒性预试验确定。同时设立阴性（溶剂）对照和阳性对照。
    • 暴露时间与采样点：
      • 短期处理（无S9）： 通常处理3-6小时，洗去受试物后更换新鲜培养基继续培养，在细胞经历约1.5个正常细胞周期时采样（如CHO/CHL约在18-24小时）。
      • 短期处理（有S9）： 处理通常为3-6小时（包含S9混合液），之后洗去处理液换新鲜培养基培养，采样时间点同无S9组。
      • 连续处理： 低毒性受试物可能采用连续处理约1.5个细胞周期的方案（如CHO/CHL约18-24小时）。
    • 中期阻断： 在采样前适当时间（通常为处理结束前几小时）加入微管抑制剂（如秋水仙素或秋水仙胺），阻断纺锤体形成，累积大量处于分裂中期的细胞。

三、染色体畸变分析

  1. 标本制备：

    • 收获细胞，低渗处理（如氯化钾溶液）使细胞膨胀，染色体分散。
    • 固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）固定细胞。
    • 将细胞悬液滴片，空气干燥。
    • 吉姆萨（Giemsa）或其他合适的染料染色。

  2. 显微镜观察与计数：

    • 在光学显微镜（通常油镜）下系统扫描制备好的中期分裂相玻片。
    • 选择染色体形态良好、分散适度、数目完整的分裂相进行分析。
    • 计数畸变类型和频率。通常每个浓度组（包括对照）分析足够数量的中期细胞（国际指南如OECD TG 473要求通常不少于200个/浓度，高变异时需增加）。

  3. 染色体畸变类型识别：

    • 染色体型畸变（Chromosomal Aberrations）： 涉及两个染色单体在相同位点断裂或重接。
      • 断裂型畸变： 裂隙（Gap - 意义尚有争议，通常单独报告）、断裂（Break）、微小体（Minute）。
      • 重接型畸变： 相互易位（Reciprocal translocation）、双着丝粒体（Dicentric chromosome）、着丝粒环（Centric ring）、末端缺失（Terminal deletion）、无着丝粒断片（Acentric fragment）、复杂重排（Complex rearrangements）。
    • 染色单体型畸变（Chromatid Aberrations）： 涉及单个染色单体断裂或改变。
      • 断裂型畸变： 染色单体裂隙（Chromatid gap - 意义有争议）、染色单体断裂（Chromatid break）、染色单体互换（Chromatid exchange）。
    • 数目畸变（Numerical Aberrations）： 非整倍体（Aneuploidy）、多倍体（Polyploidy）。虽然主要关注结构畸变，但显著诱导数目畸变也具遗传毒性提示意义。

四、结果判定与解释

  1. 阳性结果标准： 受试物组（无论有/无S9）的染色体畸变细胞率（含或不含裂隙）与溶剂对照组相比，存在统计学上的显著增加（通常 p<0.05），并且这种增加具有剂量依赖性（或可重复性）。阳性对照必须显示预期的显著诱发效应。
  2. 阴性结果标准： 在达到适当细胞毒性的浓度范围内，受试物各剂量组畸变率与阴性对照组相比无统计学显著增加，且阳性对照组结果符合预期。
  3. 裂隙的处理： 国际指南（如OECD TG 473）建议将裂隙单独报告，并在评估致突变潜力时谨慎对待。
  4. 阈值问题： 存在体外生物学意义阈值（Biological Relevance Threshold）概念，即微小的、无剂量依赖性的畸变率增加可能不具有生物学意义。
  5. 综合评价： 结果需结合细胞毒性数据、剂量-反应关系、可重复性、历史对照背景值以及代谢活化条件的结果进行综合判断。阳性结果强烈提示受试物具有致染色体断裂（Clastogenic）活性。

五、质量控制

  • 使用背景畸变率低的细胞系。
  • 严格制备S9混合液并验证其活性（通过阳性对照）。
  • 设立有效的阴性对照（溶剂）和阳性对照（已知致畸变剂，如无S9用丝裂霉素C、有S9用环磷酰胺）。
  • 采用盲法阅片或多人阅片交叉验证。
  • 良好的实验室规范（GLP）。

六、应用价值

  1. 遗传毒性筛查： 是国际通用遗传毒性标准组合试验（如ICH S2(R1)、OECD GLP组合）的核心组成部分，用于识别潜在致突变物和致癌物。
  2. 机制研究： 帮助理解化学物遗传毒性作用机制（如DNA损伤、干扰有丝分裂装置）。
  3. 风险评估： 为化学品、药品、食品添加剂等的安全性评价提供关键数据，指导风险管理决策（如分类标签、暴露限值设定、进一步试验需求）。
  4. 环境监测： 可用于评估环境污染物的遗传毒性。

七、局限性

  1. 体外到体内外推： 体外结果需谨慎外推到整体动物或人类，需结合体内试验（如微核试验、体内染色体畸变试验）综合评价。体外系统缺乏完整的吸收、分布、排泄（ADME）过程。
  2. 高浓度暴露： 体外试验往往使用较高浓度，可能产生体内生理条件下无法达到的毒性作用模式。
  3. 假阳/阴性风险： 存在因pH、渗透压、沉淀等理化因素或细胞过度毒性导致假阳性的可能；代谢活化系统无法完全模拟体内的复杂性可能导致假阴性。
  4. 检测范围局限： 主要检测染色体断裂剂（Clastogens）和部分非整倍体诱导剂（Aneugens）。对点突变的检测能力有限（需依赖基因突变试验如Ames试验）。
  5. 裂隙的意义： 染色体裂隙的生物相关性存在争议。

结论

体外哺乳动物细胞染色体畸变试验是遗传毒理学领域不可或缺的标准化工具。它通过直接观察受试物对哺乳动物细胞染色体结构和数目的损伤效应，为评估化学物质的遗传毒性风险提供了重要的实验依据。其结果对于保障人类健康和环境安全，指导化学品、药品、食品等相关产品的安全开发和监管具有不可替代的作用。然而，其结果的解释必须结合体外方法的固有局限性，并整合到更全面的遗传毒性和致癌性风险评估框架中进行综合评价。该试验的标准化和规范化执行是确保数据可靠性和可比性的关键。