急性眼刺激试验：原理、方法与意义
急性眼刺激试验（Acute Eye Irritation/Corrosion Test）是评估化学物质（包括原料、中间体、成品及混合物）意外接触眼睛后可能产生的刺激性或腐蚀性危害的重要体外及体内安全性评价方法之一。其核心目的是为化学品的安全标签、使用防护措施以及事故应急处理提供关键的科学依据。
一、 试验目的与重要性
- 危害识别： 确定受试物是否具有眼部刺激性（引起可逆性炎症）或腐蚀性（引起不可逆的组织损伤）。
- 危害分级： 根据刺激/腐蚀的严重程度，依据全球统一的分类标准（如联合国GHS制度或区域性法规）对物质进行危害分类和标签。
- 风险评估： 为制定安全操作程序（SOPs）、选择合适的个人防护装备（如护目镜）以及制定事故应急预案提供数据支持。
- 法规符合性： 满足国内外化学品管理法规（如REACH, 中国新化学物质环境管理办法等）对新物质或特定用途化学品的注册与通报要求。
二、 试验原理
该试验模拟化学物质意外溅入眼睛的场景。将一定量的受试物直接施加于实验动物的眼睛（通常为成年健康家兔），在规定时间内观察眼部组织（结膜、角膜、虹膜）出现的反应及其严重程度、性质和持续时间，从而推断该物质对人眼的潜在危害性。
三、 主要试验方法（基于体内试验 - 使用实验动物）
目前国际上公认和广泛采用的标准方法主要基于家兔模型，并遵循经济合作与发展组织（OECD）发布的测试指南 OECD 405《急性眼刺激性/腐蚀性试验》。
-
实验动物：
- 物种： 通常选用成年、健康的新西兰白兔或其他合适的品系。
- 数量： 通常至少使用3只健康的动物。若预计刺激性强，可先使用1只动物进行预判。
- 动物福利： 试验必须遵循严格的动物伦理原则（如3R原则：替代、减少、优化），并获得伦理审查委员会的批准。动物需在良好环境下饲养。
-
受试物准备：
- 形态： 液体、固体（粉末、颗粒）或糊状物。固体需研磨成细粉。
- 剂量： 通常为0.1 mL（液体）或0.1 g（固体/糊状物）。
-
试验步骤概要：
- 动物准备： 试验前检查动物眼睛，确保健康无异常。必要时使用荧光素钠检查角膜完整性。
- 给药： 轻轻拉开一侧眼睑，将受试物滴入或放入结膜囊内。避免损伤眼睛。另一侧眼作为空白或溶媒对照（如适用）。给药后轻轻闭合眼睑约1秒。
- 观察期： 通常为给药后1小时、24小时、48小时、72小时，以及第4天和第7天。若在第72小时或更早观察到严重反应（如角膜混浊、虹膜炎、结膜损伤），需观察到第21天以判断反应是否可逆。
- 冲洗（关键步骤）： 给药后立即开始观察。若在给药后即刻或早期观察（如1小时内）发现疼痛或严重刺激迹象，应立即用大量温水或生理盐水冲洗眼睛至少30分钟。OECD 405强调，任何预定观察时间点（如1小时）之前出现的持续性疼痛、角膜混浊或虹膜炎症迹象，都需要立即冲洗。 具体冲洗与否及时间点需根据受试物预期性质和即时反应灵活决定。
- 临床观察与评分： 每次观察时，使用裂隙灯生物显微镜等器械仔细检查并记录：
- 角膜： 混浊程度（透明度丧失）及范围。
- 虹膜： 炎症反应（充血、肿胀、对光反射迟钝或消失）。
- 结膜： 充血（发红）、水肿（肿胀）以及分泌物情况。
- 其他： 眼睑反应、疼痛表现（如紧闭眼睑、抓挠）、泪液分泌等。
- 评分系统： 采用经典的Draize评分系统或其改良版，对上述观察指标进行量化评分。
-
评分与结果解释：
- 根据每次观察的各部位评分，计算每只动物每只眼的刺激指数。
- 重点关注最高反应强度、反应持续时间以及反应是否可逆（区分刺激性与腐蚀性）。
- 根据观察到的损伤类型、严重程度和持续时间，参照GHS或特定法规的分类标准（通常基于角膜、虹膜损伤的程度和可逆性，以及结膜反应的严重程度）对受试物进行危害分类：
- 类别1： 引起不可逆的眼部损伤（腐蚀性）或严重可逆损伤（某些GHS分类）。
- 类别2： 引起严重程度较低的可逆性损伤。
- 无分类： 未达到上述分类标准（可能包括轻微刺激或基本无刺激）。
四、 体外替代方法的发展与应用（非动物试验）
随着动物福利要求的提高和科学技术的发展，体外替代方法在眼刺激测试领域取得显著进展，部分方法已被OECD接受或成为动物试验的有力补充和替代（尤其用于识别无刺激物或严重腐蚀物）：
-
重建人角膜上皮模型试验 (RhCE)：
- 原理： 使用体外培养的分层人角膜上皮细胞组织模型。
- 方法 (如OECD 492)： 将受试物作用于模型表面，通过测量细胞活力（MTT转化等）来预测刺激性毒性（区分类别1/无分类）。
- 应用： 主要用于识别严重眼损伤物（腐蚀物GHS类别1）和无需分类的物质。
-
鸡胚绒毛尿囊膜试验 (CAM)：
- 原理 (如OECD 438)： 观察受试物作用于受精鸡卵的绒毛尿囊膜（富含血管）后引起的血管损伤（出血、凝血）、膜毒性（浑浊、溶解）。
- 应用： 常用于区分腐蚀物（类别1）和非腐蚀物，也可提供刺激性强度的信息。
-
细胞毒性试验 (如OECD 460)：
- 原理： 测量受试物对特定细胞系（如小鼠成纤维细胞Balb/c 3T3）活力的影响。
- 应用： 常作为组合测试策略的一部分，用于初步筛查毒性。
-
离体器官试验 (如牛角膜混浊通透性试验 - BCOP, OECD 437)：
- 原理： 使用离体牛眼角膜，测量受试物引起的角膜混浊度变化和通透性增加（荧光素渗漏）。
- 应用： 预测引起角膜损伤的潜力（区分类别1/其他类别）。
-
组合测试策略 (ITS)：
- 原理： 结合多种体外方法的测试结果，利用计算机算法或决策树进行综合分析判断。
- 优势： 可覆盖更广泛的刺激终点，提高预测准确性，减少或避免动物使用。
- 目标： 最终目标是实现完全替代动物试验进行眼刺激分类。
目前体外方法主要用于识别严重眼损伤物（GHS类别1）和无需分类的物质，对于中度刺激物（GHS类别2）的精确区分仍是挑战，体内试验有时仍需用于确认分类。法规接受度取决于具体方法、验证状态和监管机构的要求。
五、 结果应用与局限性
-
应用：
- 化学品安全数据表 (SDS)： 在“危害识别”部分标明眼刺激类别和符号（如感叹号或腐蚀符号）。
- 产品标签： 张贴相应的危险象形图、信号词（如“危险”、“警告”）和防范说明（如“如进入眼内，立即用大量水冲洗并就医”）。
- 风险评估： 指导制定工程控制措施和个体防护装备（如护目镜、面罩）的选择。
- 事故应急： 明确冲洗等急救措施的重要性。
- 法规注册： 满足化学品注册法规的数据要求。
-
局限性：
- 种属差异： 兔眼与人眼在生理和解剖上存在差异（如兔泪液分泌少、眨眼频率低），可能导致对刺激物的反应程度与人不同（兔通常更敏感）。
- 主观性： 评分具有一定的主观性，需要经验丰富的实验人员进行标准化操作和评估。
- 试验本身带来的痛苦： 即使遵循伦理和麻醉/镇痛规定，试验本身仍会给动物造成痛苦和不适（这也是推动替代方法发展的主要动力）。
- 体内试验成本与时间： 动物试验成本较高，周期较长。
- 体外方法适用范围： 当前的体外替代方法还不能完全覆盖所有情况，特别是精准区分不同级别的可逆性刺激。
六、 重要说明
- 伦理优先： 体内试验必须严格遵守动物福利法规和伦理准则，优先考虑3R原则。仅在无充分有效的替代方法可用，且试验带来的社会效益远大于动物成本时方予开展。
- 法规驱动： 具体实施必须严格遵循现行有效的国际或国家法规指南（如OECD 405）以及实验室内部的标准操作规程。
- 替代方法推进： 科学界和监管机构正积极推动验证和接受更多、更可靠的体外替代方法，目标是最终取代动物试验用于眼刺激评估。
结论
急性眼刺激试验是评估化学品眼危害不可或缺的工具，直接关系到人类健康和作业安全。传统的家兔体内试验（OECD 405）仍然是重要的基准方法，但随着科技的进步，基于重建组织模型、离体器官、细胞毒性等方法组合的体外替代策略正迅速发展并被逐步纳入法规体系，显著减少了实验动物的使用。未来，持续优化现有替代方法并开发新的技术，实现更精准、更人道的眼刺激评估，是化学品安全评价领域的重要发展方向。无论采用何种方法，其结果对于保护人类免受化学品眼部伤害、制定有效的防护措施和满足法规要求都具有极其重要的意义。