脊髓灰质炎病毒检测

脊髓灰质炎病毒检测：守护无脊灰状态的关键防线

脊髓灰质炎（简称“脊灰”），曾是一种严重威胁儿童健康的传染病，可导致不可逆的终身瘫痪甚至死亡。尽管通过全球疫苗接种努力，世界卫生组织（WHO）西太平洋地区（包括中国）已在2000年实现无脊灰状态认证，但病毒传播的风险依然存在。及时、准确的实验室检测是发现潜在输入性病例或疫苗衍生病毒传播的核心手段，对于维持无脊灰成果至关重要。

一、 为何检测如此重要？

1. 早期发现与诊断： 脊灰病毒感染早期症状（如发热、头痛、呕吐等）与其他常见病毒性疾病类似，难以及时识别。只有实验室检测能提供确诊依据。
2. 鉴别诊断： 导致急性弛缓性麻痹（AFP）的病因有多种（如其他肠道病毒、格林巴利综合征等）。脊灰病毒检测是明确或排除脊灰病毒感染的关键。
3. 监测预警：
   • 病例监测： 全球消灭脊灰行动计划的核心策略是对所有15岁以下急性弛缓性麻痹（AFP）病例进行强制性脊灰病毒检测，确保不漏掉任何一例可能的脊灰病例。
   • 环境监测： 在特定区域（如高风险地区、国际交通枢纽、难民营等）定期采集污水样本进行脊灰病毒检测，作为人群感染的“早期预警系统”。
   • 疫苗株监测： 监测口服减毒活疫苗（OPV）中病毒的遗传变异情况，及时发现可能获得神经毒性和传播能力的疫苗衍生脊灰病毒（VDPV）。
4. 评估防控效果： 监测数据用于评估免疫规划覆盖率和效果，识别免疫空白人群，指导疫苗接种策略的调整。

二、 何时需要进行检测？

1. AFP病例： 所有15岁以下出现急性弛缓性麻痹症状的儿童，都是脊灰病毒检测的最高优先级对象。必须在麻痹出现后14天内采集双份粪便标本（间隔24-48小时）。
2. 脊灰病例的密切接触者： 一旦发现脊灰确诊病例或VDPV病例，其密切接触者（尤其是未全程接种疫苗者）需进行检测。
3. 来自脊灰流行或复发地区的急性发热/胃肠道疾病患者： 尤其是未接种疫苗或免疫史不详者。
4. 常规环境监测： 按既定方案在选定的污水排放点定期采样。
5. 疫苗安全性监测： 对接种OPV后发生VAPP（疫苗相关麻痹型脊灰）的罕见病例进行病毒溯源检测。

三、 核心检测方法

实验室检测主要依赖病毒学和分子生物学技术：

1. 病毒分离培养（金标准）：

   • 原理： 将粪便标本或浓缩的污水样本接种到对脊灰病毒敏感的细胞系（如L20B细胞，该细胞表达人脊灰病毒受体）中。
   • 观察： 观察细胞是否出现特征性的病变效应（CPE）。出现CPE提示可能存在肠道病毒（包括脊灰病毒）。
   • 后续鉴定： 对产生CPE的分离株，需进一步通过分子生物学方法（如PCR）或中和试验确定是否为脊灰病毒，并区分是野毒株、疫苗株还是VDPV。

2. 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）及其衍生技术：

   • 原理： 直接检测样本中的脊灰病毒RNA。
   • 常用方法：
     • 实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）： 快速筛查样本中是否存在脊灰病毒核酸，并通常能区分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊灰病毒（Ⅱ型野毒株已宣布消灭，但疫苗衍生株仍存在）。速度快，灵敏度高，是首选的初筛方法。
     • 巢式RT-PCR： 进一步提高检测灵敏度，常用于病毒载量低或部分降解的样本。
     • VP1区基因测序： 对PCR阳性产物进行基因测序是确诊和分型的最终依据。通过分析VP1区域（决定病毒血清型的关键区段）的核苷酸序列：
       • 确认是否为脊灰病毒。
       • 区分野毒株、疫苗株（Sabin株）和疫苗衍生株（VDPV）。VDPV的定义是其VP1区域核苷酸序列与原始疫苗株相比，差异超过1%（约10个以上核苷酸变异）。
       • 进行分子流行病学溯源，追踪病毒传播链。这是区分输入病例、本地传播以及识别VDPV的重要工具。

3. 血清学检测（抗体检测）：

   • 应用： 主要应用于人群免疫水平调查（血清流行病学研究），评估疫苗接种效果和人群免疫屏障强度。在急性病例诊断中作用有限，因为：
     • 需要采集急性期和恢复期双份血清（间隔2-4周）检测抗体滴度是否有4倍及以上升高才有诊断意义，耗时较长。
     • 疫苗接种史会干扰结果解读。
   • 方法： 中和试验仍是测定脊灰病毒特异性中和抗体的“金标准”。酶联免疫吸附试验（ELISA）也可用于检测抗体，但主要用于筛查。

四、 样本采集、运输与保存（至关重要！）

检测结果的可靠性极度依赖于样本质量和处理过程：

1. 粪便标本（AFP病例）：

   • 数量： 双份（至少2份），间隔24-48小时采集，每份量约成人拇指大小（5-8克）。
   • 时机： 麻痹出现后14天内采集，越早越好（病毒排出高峰期在前1-2周）。
   • 容器： 无菌、防渗漏的专用粪便采集管（内含病毒保存液）。
   • 保存与运输： 采集后立即置于4-8°C冷藏（冰包），72小时内送达指定的脊灰网络实验室（国家级或省级）。如需更长时间运输或储存，应在-20°C或更低温度冷冻（避免反复冻融）。需详细填写标本送检单（包括病例基本信息、麻痹日期、采样日期等）。

2. 环境污水样本：

   • 采集： 按标准操作规程（SOP）在选定点位采集足量污水（通常使用自动采样器或人工采集瞬时样/复合样）。
   • 浓缩： 通常在实验室进行浓缩处理（如絮凝沉淀、超滤、PEG沉淀等）以提高病毒检出率。
   • 保存与运输： 浓缩前样本通常4°C冷藏尽快运输；浓缩后样本冷冻保存和运输。

五、 实验室网络与质量控制

全球和国家消灭脊灰行动计划都建立了严格的实验室网络和质量保证体系：

1. 层级网络： 通常是三级结构：
   • 国家级脊灰参考实验室： 承担最终确认、基因测序、VDPV鉴定、技术指导、质量控制、参比试剂提供、人员培训等核心任务。
   • 省级/区域级脊灰实验室： 承担辖区内标本的初筛（如病毒分离、RT-PCR）和初步鉴定，将阳性分离株或PCR产物上送至国家级实验室确认和测序。
   • 合格的地市级实验室： 在部分国家/地区，具备条件的实验室可承担部分检测任务，确保标本快速送达。
2. WHO全球脊灰实验室网络（GPLN）： 所有国家级参考实验室都需通过WHO的认证和年度考核，遵循标准化操作程序（SOP），使用统一的试剂和判定标准，定期参加能力验证（PT），确保全球检测结果的准确性和可比性。
3. 严格的质量控制（QC）与质量保证（QA）： 贯穿于样本接收、处理、检测、结果报告、数据管理等全过程。

六、 检测结果解读与公共卫生行动

1. 阴性结果： 通常可排除脊灰病毒感染。但需结合采样时间、质量、检测方法敏感性等因素综合判断。AFP病例即使脊灰阴性，也需完成其他病因调查。
2. 阳性结果：
   • 疫苗株（Sabin-like）： 最常见于近期口服过OPV疫苗的个体或接触者。如来自AFP病例，需结合临床排除VAPP（极为罕见）。
   • 疫苗衍生脊灰病毒（VDPV）：
     • 免疫缺陷相关VDPV（iVDPV）： 在原发性免疫缺陷患者体内长期演化而来，需长期监测和隔离管理。
     • 循环型VDPV（cVDPV）： 表明疫苗株在人群中发生了持续的循环传播并演化出神经毒性和传播力，等同于野毒株的传播风险，需要立即启动大规模应急免疫（mOPV或IPV）等紧急响应！ 是当前维持无脊灰状态面临的主要威胁。
     • 不明来源VDPV/aVDPV： 与已知cVDPV传播链无关或来源不明的VDPV。
   • 野脊灰病毒（WPV）： 如果检测到野毒株，意味着输入或复发，是最高级别的公共卫生紧急事件，必须立即采取最严格的防控措施（包括大规模应急免疫、病例搜索、接触者追踪管理等）。
3. 环境阳性： 发现脊灰病毒（尤其是VDPV或WPV）提示该区域存在感染者排毒，需要追溯源头，评估传播风险，并可能启动强化免疫等响应措施。

结论

脊髓灰质炎病毒检测是消灭脊灰行动中无可替代的技术支柱。从AFP病例的强制性监测到环境污水的灵敏预警，从精确的病毒分离培养到快速的分子诊断和基因测序分型，这套高度专业化、标准化、全球化的检测体系，如同一张无形的精密监测网络，时刻警惕着病毒的蛛丝马迹。其结果的准确与否，直接关系到公共卫生响应的速度与精度，是保护来之不易的无脊灰成果、守护儿童健康的生命线。在全球彻底根除脊灰的最后阶段，持续强化和优化病毒检测能力，确保其灵敏、准确、高效运行，仍然是全球公共卫生界的核心任务之一。