小鼠精原细胞或精母细胞染色体畸变试验

小鼠精原细胞或精母细胞染色体畸变试验：原理、方法与应用

摘要： 小鼠精原细胞或精母细胞染色体畸变试验是一种重要的哺乳动物体内遗传毒性筛选方法，用于评估受试物（如化学品、药物、环境污染物等）诱导雄性生殖细胞染色体结构损伤的能力。该试验通过直接观察精原细胞有丝分裂中期或初级精母细胞减数分裂中期I的染色体异常情况，为评价受试物潜在的遗传风险和生殖毒性提供关键数据。本试验是遗传毒性标准测试组合的重要组成部分。

一、引言 遗传物质的稳定性对生物的生存和繁衍至关重要。染色体畸变是指染色体结构或数目发生的异常改变，是遗传毒性的重要表现之一。生殖细胞若发生染色体畸变，可能导致精子功能异常、胚胎死亡、先天性畸形甚至后代遗传性疾病的发生。因此，评估外来化合物对雄性生殖细胞染色体的损伤作用，对于保护人类遗传健康和评估化合物的潜在风险具有重大意义。小鼠精原细胞（处于有丝分裂增殖阶段）和精母细胞（处于减数分裂阶段）染色体畸变试验正是为此目的而设计的经典体内模型系统。

二、试验原理

1. 精原细胞染色体畸变测试： 精原细胞是精子发生的干细胞，进行活跃的有丝分裂。受试物作用于精原细胞后，可能干扰DNA或损伤染色体结构。在细胞分裂的中期，染色体高度凝缩，形态清晰，便于在显微镜下直接观察和分析染色体结构畸变（如断裂、缺失、易位、环状染色体等）。
2. 精母细胞染色体畸变测试： 初级精母细胞经历减数分裂I。在这个独特的细胞分裂过程中，同源染色体联合、配对并发生重组。受试物可能干扰这一过程或在染色体上造成损伤，导致减数分裂中期I出现异常的染色体构型（如单价体、多价体、断片、环状二价体等）。观察这一时期的细胞，能有效检测受试物对生殖细胞减数分裂过程的干扰及诱导的染色体畸变。
3. 体内暴露： 试验采用体内给药（通常经口、腹腔注射或其他相关途径），使受试物经历完整的吸收、分布、代谢和排泄过程。相较于体外试验，体内试验能更好地模拟生物体真实的生理和代谢环境，所获得的遗传毒性结果具有更高的生物学意义和风险评估价值。

三、材料与方法

1. 实验动物：

   • 通常选用健康、性成熟的雄性小鼠（如常用的品系包括CD-1, ICR, C57BL/6等）。
   • 动物饲养于符合标准的实验动物房（可控温度、湿度、光照周期），自由饮水，喂食标准饲料。
   • 试验前需进行适应性饲养。
   • 试验分组遵循随机原则，包括溶剂/赋形剂阴性对照组、阳性对照组（如已知的染色体断裂剂：环磷酰胺或丝裂霉素C作用于精原细胞；三乙撑蜜胺作用于精母细胞）以及至少2-3个剂量的受试物组。每组动物数通常5只以上。

2. 受试物与给药：

   • 受试物应充分理化表征。
   • 选择合适的溶剂或赋形剂溶解/悬浮受试物（如生理盐水、羧甲基纤维素钠溶液、植物油等）。
   • 给药途径根据受试物的性质、预期暴露途径及研究目的确定（常用经口灌胃或腹腔注射）。
   • 给药方案：
     • 精原细胞试验： 通常给药一次或多次。在单次给药情况下，通常在给药后间隔适当时间（如12、24、48小时）取样观察，以覆盖不同的细胞周期阶段。多次给药可能提高敏感性。
     • 精母细胞试验： 给药方案需考虑精子发生的时间进程。通常给药一次或多次，并在给药后采集精母细胞处于减数分裂中期I的特定时间段取样（例如给药后第12-14天或第17-19天，具体取决于给药方案和目标细胞阶段）。这需要根据小鼠精子发生周期的时间点进行精确设计。
   • 剂量设置：高剂量应产生一定的毒性迹象（如体重增长抑制），但不引起动物过度死亡；低剂量通常接近或等同于预期的人体暴露水平；中剂量介于两者之间。
   • 阳性对照组在适当时间给予已知致畸变剂。
   • 阴性对照组给予等体积溶剂/赋形剂。

3. 中期细胞制备：

   • 在预定时间点，给动物腹腔注射有丝分裂中期阻滞剂（秋水仙素或秋水仙胺溶液）。该药物阻止纺锤体微管形成，使大量细胞停滞在分裂中期，便于染色体观察。
   • 注射秋水仙素后约2-6小时（具体时间需优化），处死动物。
   • 迅速取出双侧睾丸，去除脂肪和鞘膜。
   • 精原细胞：
     • 用低渗溶液（如0.075 M KCl溶液）处理睾丸组织碎片或细胞悬液一段时间，使细胞膨胀、染色体分散。
     • 固定：通常使用新鲜配制的甲醇：冰醋酸（3:1）固定液进行多次固定。
     • 滴片：将细胞悬液滴在洁净冰冻的载玻片上，空气干燥。
   • 精母细胞：
     • 轻轻挤压曲细精管释放细胞团。
     • 低渗处理（常用1%柠檬酸钠溶液）时间通常比精原细胞稍长。
     • 固定：同样使用甲醇：冰醋酸（3:1）固定液多次固定。
     • 滴片：方法类似精原细胞。

4. 染色体标本染色与观察：

   • 玻片经适当老化后，通常用吉姆萨染液进行染色。
   • 在光学显微镜（油镜，1000倍）下进行染色体分析。
   • 观察细胞选择： 选择染色体形态良好、分散适度、着丝粒清晰、背景干净的中期分裂相进行分析。
   • 分析细胞数量： 每只动物通常分析足够数量的中期细胞（如精原细胞试验每只动物分析100个中期相，精母细胞试验分析50-100个中期I细胞）。
   • 记录的畸变类型（通常区分染色体型畸变和染色单体型畸变）：
     • 染色体型畸变（主要在有丝分裂细胞中稳定传递）： 断裂（Chromosome break, ctb）、微小体（断片, Fragment）、无着丝粒环（Acentric ring）、双着丝粒或多着丝粒体（Dicentric or polycentric chromosome）、相互易位（Reciprocal translocation）、缺失（Deletion）、插入（Insertion）、复杂重排（Complex rearrangement）等。
     • 染色单体型畸变（可能在随后的细胞分裂中发生变化）： 染色单体断裂（Chromatid break, ctb）、染色单体交换（Chromatid exchange）、染色单体缺失（Chromatid deletion）、裂隙（Gap - 通常记录但不一定计入畸变率）。
     • 精母细胞特有畸变： 除上述类型外，还需特别关注减数分裂异常，如单价体（Univalent）、多价体（Multivalent）、不对称二价体（Asymmetrical bivalent）、环状二价体（Ring bivalent）、链状二价体（Chain）等。

5. 数据记录与分析：

   • 详细记录每只动物受检的细胞总数、含有染色体畸变的细胞数、每种类型畸变发生的次数。
   • 计算：
     • 畸变细胞率 (%)： (含畸变细胞数 / 分析细胞总数) × 100% （按动物个体计算，再求组平均值）。
     • 不同类型畸变的发生频率。
   • 统计学分析：
     • 使用适当的统计方法（如卡方检验、Fisher精确检验或Dunnett's检验）比较各受试物组与阴性对照组在畸变细胞率上的差异。
     • 分析剂量-反应关系（如可能）。
     • 阳性对照组应显著高于阴性对照组，否则试验无效。

四、结果判定

1. 受试物组畸变细胞率与阴性对照组相比有统计学意义上的显著增加（通常 p < 0.05），并且这种增加具有剂量依赖性或生物学意义（即在某个剂量下出现可重复的显著升高）。
2. 特定类型畸变（尤其是染色体型畸变）的发生频率显著增加。
3. 当上述条件满足时，可判定该受试物在本试验系统中具有诱导小鼠精原细胞或精母细胞染色体畸变的阳性作用。

五、结果解释与应用

• 阳性结果： 表明受试物或其活性代谢物能够到达雄性生殖腺（睾丸），并能穿透生精小管屏障作用于生殖细胞（精原细胞或精母细胞），干扰DNA完整性或染色体分离机制，导致可观察的染色体结构损伤。这是一个重要的遗传毒性警示信号，提示该物质可能具有潜在的遗传风险和生殖毒性（如引起不育、流产或后代遗传缺陷）。
• 阴性结果： 表明在本试验条件下，在该试验所采用的剂量和给药方案下，未检测到受试物诱导雄性生殖细胞染色体结构损伤的显著证据。但这并不意味着该物质绝对无遗传毒性，需结合其他遗传毒性试验（如Ames试验、微核试验、体外染色体畸变试验等）和整体毒理学数据进行综合评估。
• 应用价值：
  • 药物安全评价： 是药物临床前遗传毒性评价标准组合（ICH S2(R1)指导原则）中推荐的体内试验选项之一，尤其关注对生殖细胞的影响。
  • 化学品/农药/食品添加剂安全性评估： 用于评估工业和日用化学品、农药、新食品成分等的潜在遗传毒性危害。
  • 环境污染物监测： 研究环境污染物对生物遗传物质的影响。
  • 机制研究： 有助于理解化学物质诱导染色体损伤的机制（如是否干扰DNA修复、影响细胞周期检查点、干扰减数分裂过程等）。

六、试验的优缺点

• 优点：
  • 体内系统： 考虑了吸收、分布、代谢、排泄（ADME）过程，能检测需代谢活化的物质。
  • 直接观察： 直接观察中期染色体结构，能检测多种类型的结构畸变。
  • 靶组织特异性： 直接评估受试物对雄性生殖细胞这一关键靶组织的遗传损伤效应。
  • 历史数据库丰富： 方法成熟，有大量的背景数据和参考值。
• 缺点：
  • 实验周期较长，操作技术要求高： 特别是精母细胞试验需要精确的给药-取样时间窗口。
  • 成本较高： 需要实验动物和相应的设施。
  • 灵敏度： 相对于体外试验或骨髓微核试验，检测某些特定类型损伤（如点突变）的灵敏度可能较低。
  • 数据分析主观性： 染色体畸变的识别和分类存在一定的主观性，需要经验丰富的阅片人员并遵循严格的标准。
  • 难以检测数目畸变（非整倍体）： 常规染色体分析方法对非整倍体的检测效率较低（通常需要FISH或其他专门技术）。

七、结论 小鼠精原细胞或精母细胞染色体畸变试验是一项重要的体内遗传毒性测试方法，能够直接检测受试物诱导雄性生殖细胞染色体结构损伤的能力。它为评估化学物质潜在的遗传风险，特别是生殖细胞遗传风险提供了关键数据。虽然该方法存在一定的局限性和操作复杂性，但其在生物体系中反映的整体效应，使其在综合遗传毒性评价和风险评估中具有不可替代的价值。试验结果需要结合其他遗传毒性终点和整体毒理学研究进行谨慎解读和综合评价。严格遵守标准操作规程（SOP）和质量控制（QC）是确保试验结果可靠性和可比性的关键。