体外哺乳类细胞染色体畸变试验

体外哺乳类细胞染色体畸变试验：原理、方法与应用

摘要： 体外哺乳类细胞染色体畸变试验是一种重要的遗传毒性筛选方法，用于检测受试物诱发哺乳动物细胞染色体结构损伤的能力。该试验被广泛用于化学品、药品、化妆品和环境污染物等的安全性评价，是国际公认的遗传毒性标准测试组合的核心组成部分之一。

1. 目的与意义

染色体的完整性对于细胞正常功能和遗传信息稳定传递至关重要。染色体畸变（Chromosomal Aberrations），包括染色体断裂、缺失、易位、环状染色体、双着丝粒染色体等，是细胞遗传物质发生严重损伤的直接证据。这种损伤可能导致细胞死亡、突变、癌变或遗传性疾病。体外染色体畸变试验的目的在于：

• 检测受试物诱发染色体结构畸变的潜力： 评估受试物是否具有遗传毒性（Genotoxicity）。
• 初步评估遗传风险： 为后续体内试验和致癌性评价提供重要依据。
• 满足法规要求： 是许多国家和国际机构（如ICH、OECD、EPA）对新化学实体进行安全性评价的强制性测试项目之一。

2. 试验原理

该试验利用体外培养的哺乳动物细胞系作为模型系统。基本原理是：

• 细胞在含有或不含有体外代谢活化系统（通常为大鼠肝脏S9组分）的培养体系中暴露于受试物。
• 受试物或其代谢产物可能作用于细胞，干扰DNA或修复过程，导致染色体断裂或错误重排。
• 暴露后，使用纺锤体抑制剂（如秋水仙素或秋水仙胺）处理细胞，阻止其进入分裂后期，将有丝分裂阻断在中期（Metaphase）。
• 收集中期分裂相细胞，低渗处理使细胞膨胀，固定后制备染色体玻片标本。
• 使用合适的染色方法（如吉姆萨染色）对染色体进行染色。
• 在光学显微镜下系统地观察分析中期分裂相细胞，识别并计数各种类型的染色体结构畸变。

3. 试验材料与方法

• 3.1 细胞系：

  • 常用细胞系需具有稳定的核型、较高的分裂指数和清晰的染色体形态。标准推荐包括：
    • 中国仓鼠卵巢细胞（CHO）
    • 中国仓鼠肺成纤维细胞（V79）
    • 小鼠淋巴瘤细胞（L5178Y TK+/-）或其他具有充分科学依据的哺乳动物细胞系。
  • 细胞应在适宜条件下（如37°C, 5% CO2）使用标准培养基（如RPMI 1640, DMEM, MEM）进行传代培养，保证其活力和遗传稳定性。

• 3.2 受试物与对照：

  • 溶剂/赋形剂对照： 使用溶解或悬浮受试物的溶剂（如生理盐水、DMSO、水）。浓度应不影响细胞生长和染色体形态。
  • 阳性对照：
    • 无代谢活化（-S9）： 使用直接致断裂剂，如丝裂霉素C、甲磺酸甲酯（MMS）、依托泊苷等。
    • 有代谢活化（+S9）： 使用需代谢活化的前致突变物/致断裂物，如环磷酰胺、苯并[a]芘。
  • 阴性对照： 通常是溶剂/赋形剂对照，用于确认试验系统的本底畸变水平正常。

• 3.3 代谢活化系统（S9混合物）：

  • 用于模拟哺乳动物的体内代谢能力（Ⅰ相代谢，主要涉及细胞色素P450酶系）。
  • 通常来源于预先经酶诱导剂（如Aroclor 1254或苯巴比妥钠/β-萘黄酮）处理的大鼠肝脏匀浆上清液（S9组分）。
  • S9混合物包含S9组分、辅因子（NADP、葡萄糖-6-磷酸盐等）和缓冲液。在试验中加入适当比例（通常为培养液终体积的1-10%）的S9混合物。
  • 试验通常设计有代谢活化（+S9） 和无代谢活化（-S9） 两组处理。

• 3.4 试验设计：

  • 剂量选择： 通过预试验（如细胞毒性试验，测定相对细胞生长率或分裂指数抑制率）确定最高剂量。最高剂量应产生一定的细胞毒性（通常建议分裂指数抑制率在50%以上，或相对细胞生长率下降至50%-60%）。设置多个剂量组（至少3个，常用4-6个），覆盖无毒到中高毒范围。同时设置阴性和阳性对照组。
  • 处理时间： 处理时间应涵盖细胞周期的大部分时间（通常1.3-1.5个正常细胞周期）。
    • 对于CHO、V79等细胞（周期约12-14小时）：常采用短期处理（3-6小时） 加或不加S9活化，处理结束后洗去受试物，更换新鲜培养基，并继续培养至细胞收获（通常总培养时间约1.5个周期）。也可采用连续处理（不间断处理直至收获，约1.5个周期） 。
    • 对于L5178Y等细胞（周期较长，约10-12小时）：通常采用连续处理约24小时（约2个周期）。
    • 每个处理组通常需要平行培养物（如双皿） 以增加细胞收获量。
  • 收获与制片：
    • 在处理结束前适当时间（通常1.5-3小时），向培养物中加入纺锤体抑制剂（秋水仙素或秋水仙胺），将分裂细胞阻断在中期。
    • 收获细胞：胰酶消化（贴壁细胞）或直接收集（悬浮细胞）。
    • 低渗处理：用低渗溶液（通常是0.075 M KCl）处理细胞，使细胞膨胀，染色体分散。
    • 固定：使用固定液（常用甲醇：冰醋酸=3：1）多次固定细胞，去除细胞质碎片。
    • 滴片：将细胞悬液滴在洁净玻片上，空气干燥。
    • 染色：通常使用吉姆萨（Giemsa）染液染色。
  • 镜检分析：
    • 在光学显微镜油镜下（1000倍）分析制备好的染色体玻片。
    • 每个剂量组和对照组应分析一定数量（通常每组100-200个，OECD 473要求至少200个/组）结构良好的中期分裂相细胞。
    • 记录每个细胞中观察到的染色体结构畸变类型和数量。
    • 分析应在盲态下进行（即阅片者不知晓标本所属组别）。
    • 应区分染色体型畸变（涉及染色单体两条臂，如断裂、缺失、环状、双着丝粒体、易位）和染色单体型畸变（仅涉及一条染色单体臂）。裂隙（Gap）通常单独记录报告，其生物学意义尚有争议，OECD指南并不要求将其作为染色体损伤的阳性证据。
    • 关键指标包括：含染色体畸变细胞百分比、每种畸变类型的频率。

4. 结果分析与评价

• 数据处理：
  • 计算各剂量组和对照组含染色体畸变的细胞率（%畸变细胞），区分染色体型畸变和染色单体型畸变（如适用）。
  • 计算总畸变细胞率（包括所有类型的结构畸变，裂隙除外）。
  • 计算畸变细胞率的标准差或标准误。
• 统计学分析：
  • 通常采用适当的统计学方法（如卡方检验、Fisher精确检验、趋势检验如Cochran-Armitage检验）比较各剂量组与阴性对照组的畸变细胞率。
  • 判断阳性结果需同时考虑统计学显著性和生物学意义。
• 结果判定标准（基于OECD 473等指南）：
  • 阳性结果：
    • 在一个或多个剂量组中出现剂量依赖性增加的畸变细胞率。
    • 和/或在一个或多个剂量组中出现统计学显著增加的畸变细胞率（与阴性对照组相比），并且这种增加超出了该实验室的历史阴性对照数据范围（生物学意义）。
    • 重现性：阳性结果应在独立的重复试验中得到证实（通常指南要求如果首次试验阳性，需进行确证试验）。
  • 阴性结果：
    • 在任何剂量组中均未出现统计学显著和/或剂量依赖性增加的畸变细胞率。
    • 阳性对照组必须显示显著的畸变率增加，证明试验系统敏感有效。
    • 阴性对照组的畸变率应在该实验室历史背景数据范围内。
    • 最高剂量应达到足够的细胞毒性水平（通常分裂指数抑制≥50%或相对细胞生长率下降至50-60%）。如果未达到，说明剂量选择可能不足，结果可能为假阴性。
  • 可疑或不确定结果： 如果结果不满足明确的阳性或阴性标准（如仅在最高剂量、无剂量依赖性、统计显著性临界、细胞毒性不足等），则可能需要重复试验或补充数据。

5. 优缺点与局限性

• 优点：
  • 灵敏度高： 能直接检测导致染色体断裂和重排的遗传损伤。
  • 相对快速、经济： 相比体内试验，周期短，成本较低。
  • 可控性强： 体外条件易于控制，可研究代谢活化影响。
  • 标准化程度高： 国际指南（如OECD 473, ICH S2（R1））提供详细方法，结果可比性好。
• 缺点与局限性：
  • 缺乏完整的体内药代动力学和毒代动力学： 不能模拟受试物在生物体内的吸收、分布、排泄过程；S9活化系统仅模拟Ⅰ相代谢，缺乏Ⅱ相代谢（结合反应）。
  • 缺乏生理屏障和修复系统： 缺少如血脑屏障、胎盘屏障的保护作用，以及体内复杂的DNA修复和免疫监控机制。
  • 高浓度暴露： 体外试验常在远高于体内可能达到的浓度下进行，可能导致非生理性效应。
  • 假阳性/假阴性风险： 如pH值、渗透压、极端细胞毒性的干扰可能引起假阳性；代谢活化不足或修复机制差异可能导致假阴性。
  • 仅检测结构畸变： 不检测基因突变或非整倍体（后者需专门试验如微核试验）。

6. 结论

体外哺乳类细胞染色体畸变试验是评估化学物遗传毒性危害的关键工具。当严格按照国际公认的标准指南（如OECD Test Guideline 473）执行，并配合充分的细胞毒性评估、合适的代谢活化以及严格的镜检分析时，该试验能提供受试物诱导染色体结构损伤能力的可靠信息。其阳性结果强烈提示受试物具有潜在的遗传毒性风险，需要进一步通过体内试验（如体内微核试验或骨髓染色体畸变试验）进行确认，并结合其他遗传毒性终点（如基因突变试验）和整体毒性研究结果进行综合风险评估。阴性结果则需要在满足试验有效性（足够细胞毒性、阳性对照有效）的前提下，结合其他遗传毒性试验结果才能得出无遗传毒性风险的结论。正确理解该试验的优缺点和局限性对于结果的科学解读至关重要。

7. 参考文献：

• OECD (2016). Test No. 473: In Vitro Mammalian Chromosomal Aberration Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. Paris: OECD Publishing.
• ICH Harmonised Guideline (2011). S2 (R1) Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use.
• Preston, R. J., et al. (1981). Mammalian in vivo and in vitro cytogenetic assays: a report of the U.S. EPA's Gene-Tox Program. Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, 87(2), 143-188.
• Galloway, S. M. (2000). Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay. Environmental and Molecular Mutagenesis, 35(3), 191-201.
• Kirsch-Volders, M., et al. (2011). Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 702(1), 7-12. (虽然主题是微核，但包含许多关于体外遗传毒性试验设计共性的重要讨论)。