单克隆抗体制备技术服务

单克隆抗体制备技术服务：原理、流程与应用

引言

抗体作为免疫系统的核心武器，以其高度的特异性识别并结合特定抗原（如病原体、异常蛋白）。1975年Georges Köhler和César Milstein发明的杂交瘤技术，革命性地实现了单克隆抗体（mAb）的体外稳定制备。单抗因其单一的抗原结合位点、一致的特异性及亲和力，在科研探索、疾病诊断与靶向治疗等领域展现出无可替代的价值。本文将系统阐述单克隆抗体制备的核心技术与流程。

一、 技术原理：杂交瘤技术与单克隆优势

1. 核心突破：细胞融合

   • 将经目标抗原免疫的小鼠（或其他宿主动物）脾脏中富含抗原特异性B淋巴细胞，与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞（通常缺乏抗体分泌能力）融合。
   • 融合剂（如聚乙二醇或电穿孔）促使细胞膜融合，形成杂交融合细胞。

2. 杂交瘤细胞的筛选与扩增

   • 融合细胞置于HAT选择性培养基中：
     • H（次黄嘌呤）、A（氨基蝶呤）、T（胸腺嘧啶）：氨基蝶呤阻断细胞正常的DNA合成通路。
     • 骨髓瘤细胞因缺乏补救合成途径关键酶（HGPRT或TK）而死亡。
     • 脾脏B细胞虽有酶但缺乏永生性，在培养中自然消亡。
     • 唯有融合成功的杂交瘤细胞，同时具备B细胞的抗体基因（含关键酶）和骨髓瘤细胞的无限增殖能力，可在HAT培养基中存活并增殖。

3. “单克隆”的本质

   • 每个杂交瘤细胞都源于一个单一的B淋巴细胞与其融合伙伴的结合。
   • 因此，由单个杂交瘤细胞无性增殖形成的克隆群体，仅分泌针对同一抗原表位、结构完全均一的抗体，即单克隆抗体。

二、 标准制备流程详解

1. 动物免疫

   • 宿主选择：通常为小鼠（BALB/c品系最常用），特定需求下也可选用大鼠、仓鼠甚至转基因动物。
   • 抗原准备：目标抗原（蛋白质、多肽、细胞、病原体等）纯化与佐剂乳化。
   • 免疫程序：多次、多部位（皮下、腹腔、足垫等）注射，刺激宿主产生强烈的抗原特异性免疫应答，富集脾脏中的特异性B细胞。血清效价监测评估免疫效果。

2. 细胞融合

   • 细胞准备：取免疫后脾脏制备单细胞悬液（含活化B细胞）；复苏培养对数生长期的骨髓瘤细胞。
   • 融合操作：将脾细胞与骨髓瘤细胞按比例混合，加入融合剂促进融合。
   • 洗涤与重悬：去除融合剂，细胞重悬于含HAT的完全培养基中。

3. 杂交瘤筛选与克隆化

   • 初筛（杂交瘤形成）：融合细胞接种于96孔板，HAT培养基培养10-14天。未融合细胞死亡，杂交瘤细胞形成小克隆。
   • 抗体分泌检测（一次筛选）：采用ELISA、免疫荧光、流式细胞术等方法，检测各孔上清液是否含有特异性结合目标抗原的抗体。筛除无分泌或非特异分泌的孔。
   • 有限稀释法克隆化（确保单克隆性）：将阳性孔细胞进行多轮（通常2-3轮）有限稀释（如0.5-5个细胞/孔），确保最终每个阳性孔内的细胞均起源于单个杂交瘤细胞，形成真正的单克隆。

4. 杂交瘤细胞扩增与建系

   • 扩增筛选得到的单克隆杂交瘤细胞。
   • 冻存备份于液氮中，建立稳定细胞株，确保长期、稳定供应同一单克隆抗体。

5. 单克隆抗体的大量生产

   • 体外培养法（常用）
     • 杂交瘤细胞在生物反应器或无血清培养基中大规模培养。
     • 收集含抗体的细胞培养上清液。
     • 优点：成分清晰可控，批次差异小，无动物源性污染风险，符合现代生物制品生产规范。
   • 体内诱生法（腹水生产 - 应用减少）
     • 将杂交瘤细胞注射入同系小鼠（通常经预处理如注射石蜡油）腹腔。
     • 杂交瘤细胞在腹腔内增殖，产生富含抗体的腹水。
     • 穿刺收集腹水。
     • 缺点：涉及动物使用，存在动物福利考量；腹水中含有大量宿主杂蛋白（如鼠IgG、白蛋白、转铁蛋白），后续纯化复杂且杂质残留风险高；批次间差异较大。

6. 抗体纯化

   • 根据应用需求选择合适的纯化方法，常用蛋白A/G亲和层析高效捕获IgG抗体。
   • 可能需要进一步精细纯化（如离子交换、分子筛层析）以达到更高纯度。

三、 现代技术发展与优化

1. 体外展示技术（噬菌体/酵母/核糖体展示）

   • 无需动物免疫，直接从大容量抗体基因库中筛选高亲和力人源化/全人源抗体片段。
   • 绕过杂交瘤技术限制，广泛用于人源抗体开发。

2. 转基因小鼠技术

   • 将人类抗体基因座引入小鼠基因组，免疫后可直接产生高亲和力人源化抗体（小鼠体内含人类可变区和小鼠恒定区）或全人源抗体（小鼠体内含人类可变区和恒定区）。
   • 显著缩短人源抗体开发周期。

3. 单B细胞分选与克隆技术

   • 利用流式细胞术或微流控技术，直接从免疫后动物或康复者外周血中分选出单个抗原特异性B细胞。
   • 获取其抗体基因进行重组表达。
   • 主要用于难以用传统方法获得的抗体（如抗高度保守抗原抗体）或直接获取天然配对的轻重链。

4. 高效筛选与自动化

   • 高通量自动化设备应用于克隆筛选、培养与检测，提升效率。
   • 先进成像与分析系统助力快速筛选高表达、稳定克隆。

四、 单克隆抗体的核心应用领域

1. 科学研究

   • 免疫检测：Western Blot（WB）、免疫沉淀（IP/Co-IP）、免疫组化（IHC）、免疫荧光（IF/ICC）、流式细胞术（FACS）的核心工具。
   • 功能研究：阻断/激活特定靶蛋白通路，研究蛋白功能。
   • 蛋白纯化：作为配体用于亲和层析纯化靶蛋白。

2. 体外诊断（IVD）

   • 免疫分析：酶联免疫吸附试验（ELISA）、化学发光免疫分析（CLIA）、侧向层析试纸条（胶体金/荧光）等的关键组分，用于检测疾病标志物、激素、病原体抗原/抗体等。
   • 病理诊断：IHC用于肿瘤分型、病原体检测等辅助病理诊断。

3. 体内诊断

   • 放射免疫显像（RII）：放射性同位素标记的单抗用于肿瘤等病灶定位。
   • 正电子发射断层扫描（PET）：抗体片段（如Fab’、scFv）标记正电子核素用于高分辨率靶向显像。

4. 治疗药物（生物药主力军）

   • 靶向治疗：特异性结合肿瘤细胞表面抗原（如CD20、HER2、EGFR、PD-1/PD-L1），通过阻断信号、介导ADCC/CDC、递送细胞毒药物等手段杀伤肿瘤细胞（如利妥昔单抗、曲妥珠单抗、帕博利珠单抗等）。
   • 免疫调节：中和炎性因子（如TNF-α抑制剂英夫利昔单抗、阿达木单抗）治疗自身免疫病；抑制免疫检查点激活免疫系统抗肿瘤。
   • 抗感染：靶向病毒或细菌毒素（如抗RSV抗体帕利珠单抗）。
   • 抗血栓/眼科疾病等：应用领域不断扩大。

五、 技术服务内容概述

专业服务机构通常提供涵盖以下环节的定制化服务：

• 抗原设计与免疫策略咨询：协助优化抗原设计（全长蛋白、表位肽、修饰蛋白等）和免疫方案。
• 杂交瘤制备全套服务：宿主免疫、细胞融合、克隆筛选（HAT培养、抗体检测）、克隆化（有限稀释）、阳性克隆鉴定与扩增、细胞冻存。
• 小规模抗体生产与纯化：提供培养上清或腹水（依需求），并进行初级或精细纯化。
• 抗体表征：特异性（ELISA、WB、IHC等）、亲和力（SPR、BLI等）、亚型鉴定、效价测定等。
• 抗体测序与人源化/亲和力成熟（可选）：获取抗体基因序列，进行人源化改造或体外进化提升亲和力。
• 重组抗体表达：利用哺乳动物细胞（如CHO、HEK293）系统表达生产重组单抗。
• 抗体标记与偶联：标记荧光染料、酶（HRP、AP）、生物素或偶联药物、毒素等。

六、 挑战与未来方向

• 人源化与免疫原性：鼠源单抗治疗应用需克服人抗鼠抗体反应（HAMA），人源化和全人源抗体是主流方向。
• 抗体工程改造：开发双/多特异性抗体、抗体-药物偶联物（ADC）、Fc区改造抗体等，增强疗效、降低副作用、拓展功能。
• 高效稳定表达：优化细胞株构建与培养工艺，提高产量与质量稳定性，降低成本。
• 新靶点发现与验证：结合组学技术发现更多治疗靶点，并利用单抗进行功能验证。
• 替代生产系统：探索植物、昆虫细胞、转基因动物（乳腺生物反应器）等替代表达系统的规模化潜力。

结论

单克隆抗体技术自诞生以来深刻变革了生命科学和医学。经典的杂交瘤技术仍是基础，而现代体外展示、转基因动物、单B细胞技术等不断拓展抗体的来源与性能边界。单抗以其卓越的特异性，已成为科学研究不可或缺的探针、体外诊断试剂的基石以及治疗重大疾病（尤其是癌症和自身免疫病）的“生物导弹”。持续的技术革新将推动单克隆抗体在更广阔的领域发挥更强大的作用，为人类健康带来更多突破。专业的技术服务则为研究者高效获得高质量单抗提供了强有力的支持平台。