热原检查-医疗器械生物安全性评价

医疗器械生物安全性评价：热原检查的核心作用与方法

热原反应是医疗器械临床使用中可能引发的严重不良反应，其根源在于器械或其材料携带的致热物质进入人体血液循环引发的发热反应。因此，热原检查成为医疗器械生物安全性评价中至关重要的环节，是保障患者使用安全的关键防线。

一 热原的本质与来源

1. 概念： 热原是指能引起恒温动物体温异常升高的物质总称。其本质主要为：
   • 细菌内毒素（Endotoxin）： 革兰氏阴性菌细胞壁外层的脂多糖（LPS），是最常见最重要的热原。具有极强的致热活性，耐高温（常规灭菌方法如湿热灭菌121℃不能完全灭活其活性）。
   • 其他微生物源成分： 如革兰氏阳性菌的肽聚糖脂磷壁酸，真菌的多糖糖蛋白等也可能具有致热性。
   • 非微生物源物质： 某些化学物质药物免疫复合物组织坏死产物等也可能具有致热活性（有时也称为“化学性热原”）。
2. 医疗器械的主要来源途径：
   • 原材料污染： 原材料（如聚合物天然胶乳动物源材料水等）在生产或储存过程中被微生物污染。
   • 生产环境污染： 生产环境（空气设备人员工器具）中的微生物污染。
   • 生产工艺过程： 清洗消毒灭菌过程不彻底或残留物引入。
   • 后期包装或储存： 包装破损或储存不当导致微生物滋生。
   • 材料降解产物： 某些材料在体内降解可能产生具有致热性的物质（较少见）。

二 热原检查的核心目标与法规要求

• 核心目标： 通过可靠的检验方法，定量或定性地评估医疗器械或其浸提液中是否存在超过安全限量的致热物质（主要是细菌内毒素），确保产品在临床使用时不会引发患者不可接受的热原反应风险。
• 法规与标准要求：
  • ISO 10993 系列标准 (医疗器械生物学评价)： ISO 10993-1 (风险管理过程中的评价与试验) 将热原测试列为关键生物学评价终点之一。ISO 10993-11 (全身毒性试验) 明确包含了热原检查的要求。
  • 各国医疗器械法规： 如中国国家药品监督管理局美国食品药品管理局欧洲医疗器械法规等均要求根据产品特性接触途径和接触时间进行热原风险评估，并在必要时进行热原检查。
  • 药典标准： 各国药典（如《中国药典》、《美国药典》、《欧洲药典》）均详细收载了细菌内毒素检查法和热原检查法（家兔法），作为强制性的法定检验方法。

三 主要热原检查方法

根据检测原理和对象，主要分为两大类：

1. 体内法：热原检查法（家兔法）

   • 原理： 将医疗器械的供试液（通常是生理盐水浸提液）按规定剂量静脉注射入健康敏感的成年家兔体内，在规定时间内连续监测家兔体温变化。通过比较注射前的基础体温和注射后的体温升高值，判断供试品是否含有致热物质。
   • 特点：
     • 历史悠久，应用广泛： 是传统的直接检测“热原活性”的方法。
     • 检测范围广： 理论上对微生物源和非微生物源的各种致热物质均有反应（但主要针对内毒素灵敏度高）。
     • 影响因素多： 家兔个体差异环境温度操作技术供试品本身特性（如pH渗透压化学成分干扰）等都可能影响结果。
     • 伦理考量： 需要使用活体动物。
     • 灵敏度： 通常不如体外鲎试验灵敏（限度一般在0.5 EU/ml）。
   • 适用范围： 通常用于不能采用细菌内毒素检查法（如存在干扰产品特性限制）或需要检测非内毒素热原的情况（尽管能力有限）。也常用于医疗器械最终产品的放行检验（尤其是一些侵入性器械）。
   • 结果判定： 根据药典规定，观察期内所有兔子体温升高总和或单个兔子升温最大值是否超过规定限度。

2. 体外法：细菌内毒素检查法（BET，鲎试剂法）

   • 原理： 利用鲎（Limulus polyphemus 或 Tachypleus tridentatus）的血液变形细胞裂解物（鲎试剂）与细菌内毒素发生特异性酶促级联反应，最终形成凝胶或产生颜色/荧光信号。通过检测凝胶形成与否（凝胶法）或信号强度（光度法：浊度法显色法荧光法），并与已知浓度的内毒素标准品进行比较，即可定量或半定量检测样品中的内毒素含量。
   • 特点：
     • 高度特异性与灵敏性： 主要针对革兰氏阴性菌内毒素（LPS），灵敏度极高（可达0.001 - 0.03 EU/ml）。
     • 快速简便： 试验时间短（一般30分钟至2小时）。
     • 定量准确： 光度法可实现精确定量。
     • 高通量： 易于自动化操作。
     • 无动物使用： 符合减少实验动物的原则。
     • 易受干扰： 样品中的某些成分（如β-葡聚糖蛋白质高盐某些金属离子螯合剂pH变化等）可能抑制或增强反应，造成假阴性或假阳性，需要进行干扰试验。
   • 主要方法变体：
     • 凝胶法： 终点判定为凝胶形成（阳性）或不形成（阴性）。半定量，常用于限度检查。
     • 浊度法（动态/终点）： 检测反应过程中溶液浊度变化（动态法实时监测浊度增加速率），定量。
     • 显色法（动态/终点）： 检测反应过程中生色底物（如偶氮化基质）释放出的黄色对硝基苯胺（pNA）或红色对硝基苯偶氮基苯酚（pNAPH）的量，定量。
     • 荧光法（动态/终点）： 检测反应过程中荧光底物（如 Boc-Leu-Gly-Arg-AMC）释放出的荧光物质（如AMC）的量，灵敏度更高，定量。
   • 关键参数：
     • 内毒素限值（L）： 根据公式 L = K / M 计算得出（K：人体每小时每公斤体重可耐受的最大内毒素量，通常为5.0 EU/kg/h；M：最大剂量，即每公斤体重在一小时内注入的器械提取物所对应的最大器械剂量）。
     • 最大有效稀释倍数（MVD）： 供试品溶液在避免干扰前提下允许稀释的最大倍数（MVD = L / λ，λ为所用鲎试剂的标示灵敏度）。
     • 干扰试验： 必须验证在供试品浓度或稀释倍数下，鲎试剂反应不受抑制或增强（回收率应在50%-200%范围内）。
   • 适用范围： 首选方法。适用于绝大多数能被浸提且浸提液经适当处理后能消除对鲎试验干扰的医疗器械及其原材料（如注射器输液器导管植入物材料接触镜护理液透析液等的水相浸提液）。

3. 新兴方法：重组C因子法

• 原理： 基于细菌内毒素激活鲎血凝固级联反应中关键因子C因子的原理，利用基因工程技术生产重组C因子（rFC）。内毒素激活rFC后，rFC切割特异性荧光底物产生可测量的荧光信号。
• 特点：
  • 高度特异性： 仅对革兰氏阴性菌内毒素（LPS）特异，不受（1,3)-β-D-葡聚糖（G因子途径激活物）干扰，理论上假阳性更低。
  • 可持续性： 不依赖天然鲎血资源，保护鲎种群生态。
  • 性能优良： 灵敏度准确性精密度等性能与天然鲎试剂相当或更优。
  • 标准化挑战： 相对较新，标准化和广泛接受度仍在推进中（部分药典如EP已收载）。
• 应用潜力： 作为细菌内毒素检查的替代方法，发展迅速，尤其适用于易受（1,3)-β-D-葡聚糖干扰的样品。

四 方法选择与策略

• 优先原则： 在可行的情况下，首选细菌内毒素检查法（BET），因其灵敏度高特异性强速度快成本较低且无需动物实验。
• 选择依据：
  1. 产品特性： 产品是否易被水浸提？浸提液中是否存在已知的强抑制作用或增强作用的物质？
  2. 接触途径与风险： 器械是否直接或间接接触循环系统脑脊液腔或皮下植入？接触时间长短？风险等级高者要求更严格。
  3. 法规要求： 特定产品是否有强制要求使用某种方法？
  4. 干扰情况： 如果BET干扰无法通过稀释或处理方法消除，则需考虑家兔法或重组C因子法。
  5. 资源与能力： 实验室是否具备相应的动物设施或仪器设备？
• 策略：
  • 对原材料或生产过程中的中间品，可结合过程控制，采用灵敏度更高的BET进行监控。
  • 对最终产品，依据法规和风险管理结论，选用家兔法（热原检查）或BET作为放行标准。
  • 对于高风险植入器械，可能需要在研发阶段和放行阶段都进行严格的微生物控制和热原/内毒素检测。

五 质量保证与风险管理

• 样品代表性： 取样需确保能代表整个批次产品。
• 浸提条件： 浸提溶剂（首选无热原水或生理盐水）、温度时间比例（表面积/体积比或重量/体积比）需标准化且经过验证，确保能充分浸提出潜在热原。
• 方法验证： 必须严格按照药典或标准要求进行方法适用性/干扰试验（对BET）或供试品溶液制备验证（对家兔法）。
• 试剂与标准品： 使用合格且有溯源性的鲎试剂内毒素工作标准品无热原水/生理盐水。
• 环境控制： 实验室环境（尤其是BET）需严格控制，避免外源性内毒素污染（如使用专用超净工作台/层流罩）。
• 人员培训： 操作人员需经过严格培训，熟练掌握操作细节和标准。
• 数据记录与追溯： 完整记录所有试验过程原始数据和结果判定。
• 基于风险： 热原检查是风险管理的一部分。需结合产品的设计材料生产工艺清洗过程灭菌效果包装预期用途等信息，综合评估热原风险，制定适宜的检测策略和可接受标准。

六 结论

热原检查是医疗器械生物安全性评价体系中不可或缺的基石，直接关系到患者使用器械的生命安全。以细菌内毒素检查法为主家兔法为辅（或特殊情况下作为替代）重组C因子法为新兴发展方向的技术格局，为医疗器械的热原风险控制提供了有力的保障。严格执行标准化的检验方法充分理解方法的原理与局限重视全过程的质量控制和基于风险的科学决策，是确保热原检查结果可靠有效最终保障医疗器械临床使用安全的核心所在。随着科技的进步和监管要求的持续完善，热原检查的方法和技术也将不断向着更灵敏更特异更可靠更动物友好的方向发展和优化。

主要参考标准：

• ISO 10993-1: 2018 医疗器械生物学评价 第1部分：风险管理过程中的评价与试验
• ISO 10993-11: 2017 医疗器械生物学评价 第11部分：全身毒性试验
• 《中华人民共和国药典》 (现行版) - 通则 1141 细菌内毒素检查法 / 通则 1142 热原检查法
• 《美国药典》 (USP) - <85> Bacterial Endotoxins Test / <151> Pyrogen Test
• 《欧洲药典》 (EP) - 2.6.14. Bacterial Endotoxins / 2.6.8. Pyrogens / 2.6.32. Test for bacterial endotoxins using recombinant factor C