体外哺乳细胞染色体畸变试验在医疗器械生物安全性评价中的应用
摘要： 体外哺乳细胞染色体畸变试验是评估医疗器械潜在遗传毒性的核心方法之一，依据国际标准ISO 10993-3和OECD 473指南进行。该试验旨在检测医疗器械或其浸提液是否可诱发染色体结构畸变，为评估其生物学风险提供关键数据。本文系统阐述该试验的原理方法结果判定及其在医疗器械生物安全性评价中的意义与局限性。
一 引言
医疗器械的生物安全性评价是确保其临床使用安全的关键环节。遗传毒性评价作为其中重要组成部分，旨在识别器械材料或其浸提液中可能损害DNA或染色体具有潜在致癌或致突变风险的物质。体外哺乳动物细胞染色体畸变试验因其灵敏度高周期相对较短可揭示直接遗传损伤机制等特点，被广泛用于医疗器械的遗传毒性筛选。
二 试验原理
该试验基于以下生物学原理： 1. 染色体损伤检测： 直接检测染色体结构损伤，包括染色体型畸变（如断裂碎片环状染色体双着丝粒体）和染色单体型畸变（如断裂交换）。 2. 细胞分裂周期利用： 在细胞分裂中期观察染色体形态，此时染色体高度凝集，结构畸变最易识别。 3. 断裂与重接机制： 受试物可能通过直接损伤DNA（诱发断裂）或干扰DNA/修复过程，导致断裂的染色体片段发生错误重接，形成畸变。 4. 终点明确： 染色体畸变是细胞遗传物质发生不可逆结构改变的明确证据，与遗传性疾病和癌症发生风险密切相关。
三 试验方法要点
试验需严格遵守OECD 473指南及ISO 10993-3附录的要求： 1. 细胞系： * 首选已建立的哺乳动物细胞系，常用的包括中国仓鼠肺成纤维细胞（如CHLCHO）、中国仓鼠卵巢细胞（CHO）或人外周血淋巴细胞。 * 细胞需具备稳定的核型较短的细胞周期较高的分裂指数和清晰的染色体形态。 2. 受试物制备： * 医疗器械浸提液： 依据ISO 10993-12，使用生理盐水植物油或适当培养基等极性/非极性溶剂，在推荐温度和时间（如37°C, 24或72小时）下浸提器械材料。浸提比例（材料表面积或重量与浸提介质体积比）是关键参数。 * 直接接触（如适用）： 对于某些材料（如可吸收降解材料），可能需要细胞直接暴露于材料或其降解产物。 * 溶剂/阴性对照： 浸提介质本身或其溶剂。 * 阳性对照： 已知能诱发染色体畸变的物质（如丝裂霉素C用于不加S9时，环磷酰胺用于加S9时），用于验证试验系统的响应性。 3. 剂量设计： * 设置多个浓度梯度。 * 最高浓度应达到： * 产生约50%的细胞生长抑制（基于细胞计数或有丝分裂指数评估）。 * 或达到浸提液的最大可测试浓度（如饱和溶液浸提介质浓度限制）。 * 或达到预先设定的上限浓度（如5 mg/mL, 10 μL/mL）。 * 低浓度应覆盖预期暴露水平并显示剂量-反应关系。 4. 代谢活化： * 目的： 模拟哺乳动物体内代谢，检测需代谢激活才具有遗传毒性的物质。 * 系统： 通常使用啮齿类动物（如大鼠）肝脏匀浆后经9000g离心得到的上清液（S9混合液），辅以辅助因子。 * 分组： 试验应包括不加S9（检测直接诱变剂）和加S9（检测间接诱变剂）两种情况下的测试。 5. 暴露与收获： * 细胞在受试物/浸提液中暴露特定时间（通常3-6小时，加S9时暴露时间较短；也可采用持续暴露至收获）。 * 暴露后更换新鲜培养基，细胞继续培养约1.5个正常细胞周期（如CHO细胞约18-22小时）。 * 收获前适当时间（如收获前1.5-3小时）加入纺锤体抑制剂（如秋水仙素），阻断细胞于分裂中期。 6. 染色体标本制备： * 收集细胞，低渗处理（低渗溶液如KCl）使细胞膨胀染色体分散。 * 固定（甲醇:冰醋酸混合液）。 * 滴片染色（常用Giemsa染色）。 7. 畸变分析： * 在光学显微镜下分析处于分裂中期的细胞。 * 记录含染色体畸变的细胞数及畸变类型（区分裂隙与真正的断裂）。 * 通常每个浓度组分析不少于200个分散良好染色体形态清晰的分裂中期细胞（通常来自双盲读片的两个分析人员）。 * 计算畸变细胞率（含畸变的细胞数/分析细胞总数×100%）及总畸变率（总畸变数/分析细胞总数×100%）。 8. 数据评估： * 统计学分析： 采用适当的统计学方法（如Fisher精确检验卡方检验）比较各浓度组与阴性对照组的畸变率是否存在显著性差异（通常p<0.05）。 * 剂量-反应关系： 评估畸变率是否随浓度增加而升高。 * 生物学意义： 统计学显著性与明确的剂量-反应关系是判断阳性的基础。即使单一高浓度组出现有统计学意义且可重复的畸变率升高（通常畸变细胞率≥对照组的2倍），也可能提示潜在风险。 * 可接受标准： 阴性对照组畸变细胞率应在实验室历史背景范围内；阳性对照必须显示预期的显著增高。试验有效性依赖于合适的细胞毒性范围（通常推荐保留50%以上存活率或生长抑制不超过50%）。
四 结果判定与应用
1. 阳性结果： 若在一个或多个浓度下，观察到具有统计学显著性且存在剂量相关趋势（或仅在高浓度下有显著且可重复的升高）的染色体畸变率增加，则判定为遗传毒性阳性。提示该医疗器械或其材料浸提物具有诱发染色体损伤的潜力。 2. 阴性结果： 若在所有测试浓度下，染色体畸变率均未出现具有统计学显著性和生物学相关性（未超过历史对照范围且有适当的细胞毒性）的升高，则判定为遗传毒性阴性。表明在该试验条件下，未检测到供试品诱导染色体损伤的证据。 3. 在医疗器械评价中的意义： * 风险识别： 是ISO 10993-3标准推荐的医疗器械遗传毒性评价组合试验（通常与基因突变试验如Ames试验搭配）的核心部分，用于识别可能导致遗传物质损伤的物质。 * 决策支持： 阳性结果提示需要高度关注该器械的潜在致癌性和/或生殖细胞突变风险，可能需进行更深入的致癌性研究或风险评估，甚至影响器械的开发和上市。 * 材料筛选与改进： 在器械研发阶段，用于筛选不同材料配方或生产工艺变更后的遗传毒性风险。 * 符合法规要求： 是满足全球主要市场监管机构（如中国NMPA，美国FDA，欧盟CE认证）对高风险医疗器械生物安全性评价的基本要求之一。 4. 典型应用场景： 该试验常用于评价与人体长期或持久接触（植入物如骨科心血管植入物）血液接触（透析器体外循环管路留置导管）含可沥滤物或降解产物的器械（聚合物器械含药物器械可吸收器械）以及新型材料器械的生物安全性。
五 试验的局限性与考量
1. 体外局限性： 缺乏完整的体内药代动力学组织分布修复机制和免疫应答。结果外推到人体需谨慎。 2. 浸提代表性问题： 浸提条件和溶剂的选择可能无法完全模拟临床使用环境下所有潜在可沥滤物的释放。 3. 高浓度挑战： 高测试浓度导致的细胞毒性效应可能干扰畸变观察（过度的细胞死亡或细胞周期阻滞），或产生非生理条件下的假阳性（如极端pH高渗透压）。 4. 假阴性与假阳性风险： * 假阴性： 检测不到仅作用于特定靶器官或需要特定代谢途径的物质；特定类型的损伤（如非整倍体诱发剂）检出效率可能不如微核试验。 * 假阳性： 某些非遗传毒性物质在高浓度下可能因细胞毒性间接导致畸变率升高。 5. 结果解读复杂性： 区分真正的遗传毒性效应与非特异性的细胞毒性效应有时存在挑战。 6. 需组合试验： 单一试验结果不足以全面评估遗传毒性风险，必须结合其他遗传毒性终点（如基因突变DNA损伤）的试验结果进行综合判断。阴性结果通常需至少两项不同遗传学终点试验支持。
六 结论
体外哺乳细胞染色体畸变试验是医疗器械生物安全性评价体系中不可或缺的关键遗传毒性试验。其通过直接检测染色体结构损伤，为评估医疗器械材料及其释放物是否具有致突变和潜在致癌风险提供了重要的科学依据。严谨执行标准化的试验方案合理的浸提策略恰当的剂量选择和结果解读标准，并结合其他遗传毒性试验数据及器械的整体风险受益评估，是准确利用该试验保障医疗器械临床应用安全性的核心。理解其优势和局限性对于科学决策和风险管理至关重要。
参考资料：
- ISO 10993-3: 2014 Biological evaluation of medical devices - Part 3: Tests for genotoxicity, carcinogenicity and reproductive toxicity.
- OECD Guideline for the Testing of Chemicals, No. 473: In Vitro Mammalian Chromosomal Aberration Test. (Adopted: July 2016).
- ISO 10993-12: 2021 Biological evaluation of medical devices - Part 12: Sample preparation and reference materials.
- 医疗器械生物学评价标准汇编（相关国家标准及行业指南）。