霉菌和酵母菌总数检测：方法与要点
一 检测目的与意义 霉菌和酵母菌广泛存在于自然环境和各类基质中。在食品药品化妆品饮用水及环境样本中，其总数是评价样品卫生质量安全性和稳定性的关键微生物指标：
- 卫生状况指示： 反映生产加工储存运输环节的卫生控制水平。
- 腐败变质预警： 霉菌和酵母菌过度繁殖会导致产品腐败变质，产生异味异色质地改变。
- 潜在安全风险： 部分霉菌能产生危害健康的真菌毒素（如黄曲霉毒素），部分酵母菌可能导致产品发酵或感染。
- 保质期评估： 监控其在产品中的数量变化对预测保质期至关重要。
- 法规符合性： 满足相关国家标准行业标准及法规的强制性要求。
二 检测原理 基于微生物培养技术：
- 样品处理： 代表性样品经无菌操作制成均匀悬液，通常需要进行系列稀释以获得适宜计数的平板。
- 选择性培养： 将稀释液涂布或倾注于含特定营养成分和抑制剂的固体培养基（如孟加拉红培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基）。
- 营养基质： 提供霉菌和酵母菌生长所需碳氮源。
- 抑制剂： 常用氯霉素或金霉素抑制细菌生长，降低干扰。
- pH调节： 培养基通常呈弱酸性（pH 5.6 ± 0.2），更利于霉菌和酵母菌生长，抑制部分细菌。
- 适宜培养： 在特定温度（通常25-28°C）下倒置培养足够时间（通常5天，霉菌生长缓慢的样品或标准可能延长至7天）。
- 菌落计数： 培养结束后，计数平板上生长的典型霉菌和酵母菌菌落总数（Colony Forming Units, CFU）。
三 主要仪器设备与材料
- 无菌操作环境： 生物安全柜或超净工作台。
- 恒温培养箱： 可精确控温于20-25°C或25-28°C范围。
- 均质设备： 拍击式均质器或旋转刀式均质器（带无菌均质袋）。
- 恒温水浴箱： 用于融化并保温培养基（45-50°C）。
- 天平： 感量0.1 g。
- 移液器及吸头： 无菌，量程覆盖1 mL及0.1 mL。
- 稀释容器： 无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液无菌试管（具塞）无菌稀释瓶。
- 培养皿： 无菌，直径90 mm。
- 计数工具： 菌落计数器或标记笔。
- 培养基： 孟加拉红培养基（Rose Bengal Agar, RBA）或马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato Dextrose Agar, PDA），按标准配制灭菌。使用前按要求加入无菌抑制剂。
- 稀释液： 无菌生理盐水（0.85-0.90%）或磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L， pH 7.2）。
四 检测流程
- 样品接收与保存：
- 记录样品信息（名称批号数量状态接收日期时间）。
- 尽快检测，若不能立即处理，按标准要求冷藏（通常2-5°C）或冷冻保存，避免反复冻融。
- 样品制备与稀释：
- 无菌操作： 所有步骤在生物安全柜/超净台内进行，人员穿戴无菌防护装备。
- 固体/半固体样品： 无菌称取25 g样品，加入225 mL无菌稀释液，均质（8000-10000 r/min， 1-2 min）制成1:10初始悬液。
- 液体样品： 无菌吸取25 mL样品，加入225 mL无菌稀释液，混匀成1:10初始悬液（或直接检测原液）。
- 系列稀释： 用无菌吸管吸取1:10悬液1 mL，注入盛有9 mL无菌稀释液的试管中，振荡混匀成1:100稀释液。同法制备1:10001:10000等更高稀释度（根据预估污染程度选择2-3个适宜稀释度）。
- 接种与培养：
- 倾注法： 吸取1 mL各稀释度样液（包括原液或1:10液）于无菌培养皿中（每个稀释度做2个平行）。将冷却至45-50°C的培养基约15 mL倾注入培养皿，立即水平旋转混匀，待琼脂凝固。
- 涂布法： 取0.1 mL或0.2 mL各稀释度样液（根据标准要求）滴加于已凝固的培养基平板中央，用无菌涂布棒均匀涂布整个表面。
- 空白对照： 取空白稀释液1 mL（倾注法）或0.1 mL/0.2 mL（涂布法）做对照，操作同上。
- 培养： 待琼脂完全凝固，将平板倒置于恒温培养箱中，按规定温度（如28°C）培养规定时间（如5天或7天）。
- 菌落计数与报告：
- 观察： 培养结束后，立即计数各平板上的菌落数。必要时借助放大镜或菌落计数器。注意区分霉菌和酵母菌菌落形态（霉菌：丝状绒毛状絮状扩散；酵母菌：湿润光滑粘稠凸起）。如菌落蔓延覆盖平板1/2以上，应记录蔓延状况。
- 选择平板： 选取菌落数在10 CFU - 150 CFU之间的平板（霉菌较多时可放宽至50 CFU）进行计数。同一稀释度两个平板均符合要求时，计算平均值。
- 计算： 根据选择平板的稀释度及接种量，计算每克（或每毫升）样品中霉菌和酵母菌总数。
- 公式： N = ΣC / [(n1 + 0.1n2) * d]
- N：样品中霉菌和酵母菌总数（CFU/g 或 CFU/mL）
- ΣC：所有计数平板（符合计数范围）的菌落数之和
- n1：第一个稀释度（低稀释度）的平板计数数量
- n2：第二个稀释度（高稀释度）的平板计数数量
- d：第一个稀释度的稀释因子（如第一个计数稀释度为1:100，d=100）。
- （注：具体公式表述可能因标准略有差异，如GB 4789.15-2016表述为 N = (∑C / (n1 + 0.1n2)) × d，原理相同）
- 报告：
- 结果以 CFU/g（固体）或 CFU/mL（液体）表示。
- 结果在100以内时，按实测数值报告。
- 结果大于或等于100时，采用两位有效数字报告，必要时用10的指数形式表示（如 1.5 × 10^3 CFU/g）。
- 若所有稀释度平板均无菌落生长，报告结果为 < 1 × 最低稀释度（如最低稀释度1:10，报告 < 10 CFU/g 或 < 10 CFU/mL）。
- 若平板上菌落蔓延无法计数，报告菌落蔓延。
- 记录所采用的检测标准（如 GB 4789.15）。
五 结果记录表示例
六 关键控制点与注意事项
- 无菌操作： 贯穿整个流程，防止环境微生物污染。
- 样品代表性： 确保所取样品能代表整批。
- 稀释均匀性： 每次稀释前必须充分混匀悬液。
- 培养基质量控制： 新批号培养基应进行适用性检查（无菌性及促生长试验）。
- 培养温度与时间： 严格遵守标准要求，温度波动会影响生长速率和菌落形态。
- 及时计数： 培养结束立即计数，避免菌落继续生长或干燥。需区分霉菌酵母菌和可能的残留细菌菌落（后者通常更小光滑湿润不扩散）。
- 培养基倾注温度： 过高损伤微生物，过低易凝固混合不均。
- 抑制剂有效性： 确保抑制剂无菌加入且浓度准确。
- 数据记录： 清晰完整及时记录原始数据，包括任何异常情况（如蔓延）。
- 生物安全： 处理霉菌孢子时注意防护（在生物安全柜操作），避免吸入。
七 常见问题与处理
- 菌落蔓延：
- 原因： 稀释度不够低培养基过湿培养时间过长产蔓延孢子的霉菌（如毛霉根霉）。
- 处理： 报告“菌落蔓延”，可尝试选择稀释度更高的平板计数（如果可用），或重新检测优化稀释度及倾注量（如减至12-15mL培养基），或在培养48-72小时后提前观察计数一次。
- 细菌干扰：
- 原因： 抑制剂失效样品中细菌含量过高。
- 处理： 检查抑制剂配制与加入过程是否规范；若干扰严重，可采用含更强抑制剂（如玫瑰红+氯霉素+金霉素）或更低pH的改良培养基，或考虑在倾注前加入适量无菌琼脂覆盖层。
- 菌落难以区分：
- 处理： 参考标准图谱，结合形态观察（显微镜镜检确认）。多数标准要求报告总数（霉菌+酵母菌）。
- 平板无菌落生长：
- 处理： 确认操作无误（如稀释液培养基培养条件正确），按标准报告最低检测限以下的结果（如 < 10 CFU/g）。
八 结论 霉菌和酵母菌总数检测是评估各类产品及环境微生物卫生质量的基础方法。严格遵循标准化操作流程（如国家标准GB 4789.15），控制关键环节（无菌操作准确稀释适宜培养正确计数），并客观记录报告结果，是确保检测数据准确可靠有效服务于产品质量控制和风险评估的关键。实验人员需熟练掌握技术要点并理解其原理，以应对检测中可能遇到的问题。