体外哺乳动物细胞基因突变试验：原理、方法与评价
摘要： 体外哺乳动物细胞基因突变试验是遗传毒性评价体系的重要组成部分，用于鉴定化学物质诱导哺乳动物体细胞基因水平突变的能力。该试验因其相对快速、经济且可直接反映哺乳动物基因组潜在损伤的优势，广泛应用于药物安全性评价、化学品风险评估和环境污染物检测等领域。
一、试验目的与原理 该试验旨在检测受试物能否引起培养的哺乳动物体细胞在特定基因位点（靶基因）发生可稳定遗传的突变。基本原理是：
- 靶基因选择： 通常选择对细胞生存非必需、具有明确遗传背景且突变易于检测的基因。常用基因位点包括：
- 胸苷激酶 (tk) 基因： 位于常染色体上（如小鼠淋巴瘤L5178Y细胞系、人类淋巴母细胞TK6细胞系）。正常细胞（tk+/-）可利用外源胸苷，其突变体（tk-/-）因缺乏TK酶，无法利用外源胸苷，但能在含有三氟胸苷（TFT）的选择性培养基中存活（因TFT不能被TK磷酸化为毒性形式），而野生型细胞则被杀死。
- 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (hprt) 基因： 位于X染色体上（如中国仓鼠卵巢CHO细胞系、中国仓鼠肺V79细胞系）。正常细胞（hprt+）能利用次黄嘌呤，其突变体（hprt-）因缺乏HPRT酶，无法利用次黄嘌呤，但能在含有6-硫代鸟嘌呤（6-TG）或8-氮杂鸟嘌呤（8-AG）的选择性培养基中存活（因嘌呤类似物不能被HPRT代谢为毒性核苷酸），而野生型细胞被杀死。
- 黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (gpt) 基因： 常作为转基因细胞系（如AS52/gpt+）的靶标。
- 突变表达期： 给予受试物处理后，细胞需在非选择性条件下培养一段时间（通常7-10天），允许：
- 诱导的DNA损伤修复或固定为稳定的突变。
- 细胞内残留的野生型基因产物（酶）被稀释或降解。
- 突变体选择与定量： 将细胞接种于含相应选择性药物的培养基中培养足够时间（通常7-14天）。只有发生了靶基因位点突变（并经历了表达期）的细胞才能在相应选择性药物作用下存活并形成克隆。计数形成的突变克隆数，并同时测定接种细胞的群体效率（在非选择性培养基中形成克隆的能力），最终计算突变频率：
突变频率 (MF) = (突变克隆数 / 接种细胞数 × 群体效率) × 可存活系数（如有）或更常见地表示为每10^6个存活细胞中的突变体数。
二、试验系统
- 常用细胞系：
- L5178Y tk+/- 小鼠淋巴瘤细胞： 常用于TK位点试验，也可检测大片段缺失等染色体水平损伤。
- TK6 tk+/- 人淋巴母细胞： 人类来源，核型稳定，自发突变率低。
- CHO (中国仓鼠卵巢) 细胞/V79 (中国仓鼠肺) 细胞： 常用于HPRT位点试验。染色体数目稳定，生长快。
- AS52/gpt+ 细胞： 中国仓鼠卵巢细胞系，含单个拷贝的细菌gpt基因，用于gpt位点试验。
- 培养条件： 细胞在适宜的培养基（如RPMI 1640、DMEM/F12等含血清或无血清培养基）中，置于37°C、5% CO2的恒温培养箱中培养。定期传代以维持对数生长期细胞状态。
三、试验设计与流程
- 剂量选择： 通过初步的细胞毒性试验（如相对悬浮生长、相对群体效率）确定最高剂量（通常引起50-80%的细胞生长抑制或存活率下降），并设置至少4个几何级数递减的剂量组和一个溶剂/空白对照组。高剂量应能观察到明显的细胞毒性，但不宜导致培养液显著沉淀或pH剧烈变化。
- 代谢活化系统 (+S9 Mix)： 为检测需代谢活化的前致突变物，试验通常需包含添加外源性哺乳动物肝微粒体酶系统（S9 Mix）的试验组。S9 Mix通常来源于经多氯联苯等诱导剂处理的大鼠肝脏，含有细胞色素P450酶系等代谢酶，并补充辅因子（NADPH生成系统）。试验组设置通常包括：
- 不加S9 Mix的试验组（直接诱变剂检测）
- 加S9 Mix的试验组（前致突变剂检测）
- 溶剂/空白对照组（不加S9 Mix和加S9 Mix）
- 阳性对照组（不加S9 Mix和加S9 Mix）
- 受试物处理： 对数生长期细胞暴露于不同浓度的受试物（溶于适当溶剂）中3至6小时（加S9 Mix组处理时间通常较短，如3-4小时；不加S9 Mix组可适当延长至6小时），期间保持振荡（悬浮细胞）或轻柔摇动（贴壁细胞）。处理结束后，离心去除含受试物的培养液，细胞用缓冲液或新鲜培养基洗涤。
- 表达期： 处理后的细胞在非选择性条件下培养7-10天，定期传代以维持细胞密度处于适宜范围。此期间需监测细胞毒性（群体倍增时间、群体效率）。
- 突变体选择：
- 测定群体效率 (PE₀)：取适量细胞接种于不含选择剂的培养基中培养（通常6-10天），计算群体效率（形成的克隆数 / 接种细胞数 × 100%）。
- 测定突变频率 (MF)：取大量细胞（通常TK试验接种~2000细胞/皿，HPRT试验需更多）接种于含相应选择性药物（如TFT、6-TG）的培养基中。同时设置群体效率测定板（不含选择剂）。
- 所有培养皿置于培养箱中培养适宜时间（通常7-14天）。
- 克隆计数： 培养结束后，固定细胞（如甲醇），染色（如吉姆萨染液），计数肉眼可见的克隆（通常直径 ≥ 0.5 mm）。计算群体效率 (PEₜ) 和突变频率 (MF)。
四、数据分析与结果判定
- 数据处理：
- 计算各组群体效率 (PE₀ 和 PEₜ)。
- 计算各组突变频率 (MF)。
- 变异系数：通常要求对照组和阳性对照组平行样本间MF的变异系数在可接受范围内。
- 统计检验：采用适当的统计方法（如Dunnett检验、线性回归分析、Fisher精确检验等）比较各剂量组MF与溶剂对照组MF的差异是否具有统计学显著性（通常 p<0.05）。
- 结果有效性标准：
- 溶剂对照组： 自发突变频率应在所用细胞系和实验室的历史数据范围内。
- 阳性对照组： 使用已知直接诱变剂（如乙基甲磺酸钠 EMS，不加S9）和已知前致突变剂（如环磷酰胺 CP，加S9）必须诱导出显著高于溶剂对照组的突变频率。
- 细胞毒性： 最高剂量组应观察到预设的毒性水平（如存活率降至50-20%）。
- 可评价性： 对照组和阳性对照组的数据应符合要求，试验剂量范围设置合理。
- 结果判定标准（通常遵循如OECD 490/ICH S2(R1)等国际指南）：
- 阳性结果： 在一个或多个剂量组（无论是否加S9 Mix）中观察到：
- 突变频率呈现剂量依赖性增加（或可重现的明显升高），且
- 该增加具有统计学显著性（p<0.05）。
- 阴性结果： 在所有剂量组（无论是否加S9 Mix）中均未观察到具有统计学显著性和生物学意义的突变频率增加。
- 可疑结果/试验无效： 不符合有效性标准，或数据模式不清晰（如仅在极高毒性剂量下出现微弱反应），需重复试验进一步确认。
- 阳性结果： 在一个或多个剂量组（无论是否加S9 Mix）中观察到：
五、试验的优势与局限性
- 优势：
- 直接检测基因水平点突变、小片段缺失/插入等遗传事件。
- 使用哺乳动物细胞，包含与人类相关的DNA修复、代谢（结合S9）等过程。
- 相对体内试验周期短、成本低、通量高。
- 是国际认可的遗传毒性标准组合试验之一（通常与细菌回复突变试验和染色体损伤试验组合）。
- 局限性：
- 体外系统无法完全模拟体内复杂的生理环境（如吸收、分布、排泄、免疫系统）。
- 高浓度受试物可能导致非生理条件的暴露（如高渗透压、pH改变），产生假阳性（无关诱变的细胞毒性效应）或假阴性（过度毒性掩盖效应）。
- 靶基因位点有限，不能检测所有类型的遗传损伤（如非整倍体）。
- 需要仔细排除因选择药物本身的细胞毒性或实验操作造成的假象。
- Hprt试验在已知或可疑非整倍体诱导剂中可能不敏感。
六、应用与展望
体外哺乳动物细胞基因突变试验是药物、化学品、食品添加剂、农药、化妆品原料等安全性评价中不可或缺的工具，其结果对预测潜在致癌性、评估生殖发育风险具有重要意义。随着分子生物学技术的发展，该试验也在不断进化：
- 分子分析： 对突变体克隆进行测序分析突变谱，提供更深入的机制信息。
- 高通量技术： 探索基于荧光激活细胞分选（FACS）、基因编辑（如CRISPR/Cas9）或高通量测序（如Duplex Sequencing）的新方法，提高灵敏度、通量和分辨率。
- 体外到体内外推 (IVIVE)： 结合药代动力学建模，更好地将体外浓度-效应关系转化为体内风险。
- 整合测试策略 (IATA)： 作为遗传毒性测试组合（如ICH S2(R1)）的核心部分，结合体外和体内方法，并纳入权重证据分析方法，提高风险预测的准确性并减少不必要的动物试验。
结论： 体外哺乳动物细胞基因突变试验是一个成熟、可靠且被广泛应用的遗传毒性检测平台。通过严格遵循国际标准化的试验方案和质量控制要求，该试验能有效识别可能对人类基因组完整性构成威胁的诱变剂。理解其原理、方法、优势与局限，对于科学解读试验结果、进行准确的风险评估至关重要。该试验将继续在保障人类健康和环境安全方面发挥关键作用，并随着科学进步不断优化。