化妆品体外哺乳动物细胞染色体畸变试验指南
一、 引言
遗传毒性是化学品（包括化妆品原料及终产品）安全性评价的核心关注点。体外哺乳动物细胞染色体畸变试验作为重要的遗传毒性筛选方法，专门用于检测受试物是否会引起哺乳动物细胞染色体结构损伤（如断裂、裂隙、交换、多倍体等）。此类损伤是基因突变及潜在致癌性的重要预警信号。该试验因其高效、快速、相对经济的特点，被广泛应用于化妆品原料安全评估及产品风险筛查，是国际公认的化妆品安全评价标准测试组合中的重要组成部分。
二、 试验目的
本试验旨在通过体外培养系统，评估受试化妆品或其原料成分在加和不加代谢活化系统的条件下，诱导哺乳动物培养细胞染色体数目和/或结构畸变的能力，从而预测其潜在的遗传毒性风险。
三、 试验原理
- 细胞培养： 选用公认的哺乳动物细胞系（如中国仓鼠肺细胞系-CHL、中国仓鼠卵巢细胞系-CHO、人或小鼠淋巴瘤细胞系-L5178Y TK+/-）进行体外培养至合适密度。
- 受试物暴露： 将细胞暴露于一系列浓度梯度的受试物中一段时间。通常设置短时处理（3-6小时，±代谢活化）和持续处理（约1.5个正常细胞周期，约18-24小时，无代谢活化）两种方案。
- 代谢活化（S9 Mix）： 为了模拟体内代谢过程，部分试验需在暴露时加入含有混合功能氧化酶（来源于啮齿类动物肝脏匀浆并经诱导的S9组分）的代谢活化系统（通常称为“+S9”条件），以检测需代谢激活才具有遗传毒性的物质。另一部分试验则在无代谢活化系统（“-S9”条件）下进行。
- 细胞周期阻滞： 在收获细胞前适当时间（通常在暴露结束前1.5-2小时），加入纺锤体抑制剂（如秋水仙碱或秋水仙胺类似物），阻止细胞进入分裂后期，将分裂中的细胞阻滞在分裂中期（Metaphase）。此时染色体形态最为清晰，便于观察。
- 细胞收获与制片： 收集细胞，经低渗处理（使细胞肿胀、染色体分散）、固定（常用甲醇：冰醋酸混合液）后，滴片制成染色体标本玻片。
- 染色体染色与分析： 玻片经吉姆萨(Giemsa)或其他适宜染色剂染色后，在光学显微镜下观察处于分裂中期的细胞。由经验丰富的分析人员对足够数量的中期分裂相进行染色体畸变（Chromosomal Aberrations, CAs）计数和分类。主要观察指标包括：
- 染色体型畸变： 影响两条染色单体（如断裂、裂隙、双着丝粒体、环状染色体、易位、粉碎化等）。
- 染色单体型畸变： 仅影响一条染色单体（如单体断裂、裂隙、交换等）。
- 数目畸变： 多倍体、内（Endoreduplication）。
- 统计学分析： 计算各剂量组及对照组畸变细胞的频率（含畸变的分裂细胞数/观察的分裂细胞总数）及各类畸变的发生率。采用适当的统计学方法（如Fisher精确检验、卡方检验）判断受试物各剂量组与阴性对照组之间是否存在显著性差异。
四、 试验方法要点
- 受试物： 固体需溶解或悬浮于适当溶剂（首选水或生理盐水，其次为DMSO、乙醇），液体可直接测试或稀释。需选择不影响细胞活力且无细胞毒性和遗传毒性的溶剂，并设置溶剂对照组。
- 细胞选择： 推荐使用核型稳定、分裂率高、染色体形态清晰且数量适中的细胞系。
- 剂量设置：
- 应包含产生明显细胞毒性（通常基于细胞生长抑制率或相对细胞计数，推荐抑制率约50%）的最高剂量。
- 至少设置3个有适当间距的检测浓度。
- 设置阴性（溶剂）对照组和阳性对照组。
- 阳性对照组： 无论是否存在代谢活化系统，都应使用已知的阳性突变剂来验证试验系统的敏感性。
- -S9条件下： 常选择丝裂霉素C（Mitomycin C）、秋水仙碱（Colchicine）。
- +S9条件下： 常选择环磷酰胺（Cyclophosphamide）。
- 细胞毒性评估： 需平行测定细胞毒性（如相对细胞计数、相对有丝分裂指数），确保选择的最高剂量能反映适当的毒性水平。
- 观察细胞数： 通常每个试验点（每个剂量/对照组，每种处理条件）至少分析200个分布良好的中期分裂相（通常来自双盲阅片的两个独立分析人员）。
- 试验周期： 需在加和不加代谢活化系统条件下分别进行试验。
五、 结果判定
- 阳性结果：
- 受试物引起染色体畸变细胞率出现剂量依赖性增加和/或某一剂量点的畸变率与阴性对照组相比有统计学显著性增加（p<0.05）。
- 试验系统有效（阳性对照组显著高于阴性对照，阴性对照组在历史背景范围内）。
- 阴性结果：
- 所有检测浓度下，受试物均未引起染色体畸变细胞率出现具有统计学意义的增加。
- 试验系统有效（阳性对照显著高于阴性对照，阴性对照组在历史背景范围内）。
- 选择的最高剂量达到了足够的细胞毒性水平（通常为约50%细胞抑制）。
- 可疑或不确定结果： 若结果模棱两可（如仅在最高剂量出现微弱、无统计学意义的增高，或细胞毒性过大导致可分析分裂相不足），则需考虑重复试验或进行进一步研究。
六、 适用范围与局限性
- 适用范围： 主要用于化妆品原料及终产品的遗传毒性初筛和风险评估。可为安全性评价和法规申报提供关键数据。
- 局限性：
- 体外局限性： 缺乏完整的吸收、分布、排泄（ADME）过程和体内屏障。
- 终点局限性： 主要检测染色体水平的损伤（大缺失、重排等），对基因点突变的检测能力有限（需通过其他试验如Ames试验补充）。
- 假阳性/假阴性风险： 高浓度、高渗透压、极端pH、高细胞毒性等因素可能导致假阳性；某些特定类型的损伤（如非整倍体诱导剂）可能不易被标准方案检出；代谢活化系统无法完全模拟体内代谢。
- 需组合测试： 因其局限性，体外染色体畸变试验结果需结合其他遗传毒性试验（如细菌回复突变试验-Ames试验、体外微核试验等）和整体毒理学数据进行综合评估。
七、 法规与指南依据
本试验的设计、执行和结果解释严格遵循国际公认的指南，主要包括：
- 经济合作与发展组织 (OECD) 测试指南 No. 473： 《体外哺乳动物细胞染色体畸变试验》。
- 国际标准化组织 ISO 10993-3： 《医疗器械生物学评价 第3部分：遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验》（部分参考）。
- 中国国家标准 GB/T 15670： 《农药登记毒理学试验方法》相关部分（提供通用方法学参考）及《化妆品安全技术规范》中遗传毒性相关要求。
八、 试验报告内容
完整报告应包含：
- 受试物信息（名称、编号、理化特性、溶剂、浓度）。
- 所用细胞系及来源。
- 试验条件（处理浓度、处理时间、代谢活化细节、收获时间、阻断剂使用）。
- 细胞毒性测定方法及结果。
- 分析的分裂相数量（每个点）。
- 每个浓度组和对照组各类染色体畸变（断裂、裂隙、交换、多倍体、内等）的数量和频率。
- 畸变细胞率及统计分析结果。
- 阳性对照和阴性对照结果。
- 试验结论（阳性、阴性或不确定）。
- 试验日期、操作者、实验室环境记录。
- 符合GLP声明（如适用）。
九、 重要性及在化妆品安全评估中的角色
体外哺乳动物细胞染色体畸变试验是识别化妆品成分潜在遗传毒性危害的关键一步。阳性结果表明受试物具有诱导染色体损伤的能力，提示其可能具有致癌性或遗传风险，对此类物质需进行更严格的风险评估（如修改配方、降低使用浓度、严格限定暴露条件），甚至可能排除在化妆品中使用。阴性结果则是在评估产品整体安全性时的重要支撑数据。该试验为保护消费者免受潜在遗传毒性物质的危害提供了重要的科学依据。
十、 注意事项
- 严格遵守实验室生物安全规范。
- 所有操作需确保无菌，避免污染。
- 分析人员需经过严格培训，识别畸变标准需一致，实施双盲阅片。
- 受试物的溶解性、稳定性、无菌性需在试验前确认。
- 溶剂选择至关重要，需确保其本身无细胞毒性和遗传毒性，且不影响受试物活性。
- 需有详细、准确、可追溯的实验记录。
通过严谨执行本试验方案并科学解读结果，可为化妆品的安全性提供重要的遗传毒性学证据，保障消费者的健康权益。综合评估遗传毒性试验结果，结合其他毒理学终点，是化妆品原料和产品安全评估不可或缺的环节。