化妆品急性眼刺激性/腐蚀性试验 - 中析研究所生物检测中心

化妆品急性眼刺激性/腐蚀性试验指南

一、引言

化妆品直接应用于人体皮肤、毛发、指甲、口唇等部位，其安全性至关重要。眼部粘膜组织极其脆弱敏感，对化学物质反应强烈。评估化妆品及其原料接触眼睛后可能导致的急性刺激性或腐蚀性损伤，是保障消费者眼部安全的关键环节。本试验旨在通过标准化程序，评估受试物一次接触动物眼睛后短期内所产生的眼部损伤及其可逆程度，为化妆品产品的安全评估提供科学依据。

二、目的

依据国际通行的毒理学试验准则（如OECD指南405），本试验旨在：

鉴别受试物是否具有眼刺激性或腐蚀性。
评估眼组织接触受试物后所产生的损伤性质、严重程度及其随时间变化的进程（可逆性）。
为化妆品安全风险评估提供基础数据，指导产品标签警示语的制定（如“避免接触眼睛”）。

三、试验原理

将定量的受试物直接滴入（或涂敷于）实验动物（通常为健康成年家兔）的一只眼睛结膜囊内。另一只未处理眼作为同期对照。在预设的时间点（如染毒后1小时、24小时、48小时、72小时以及第4天和第7天或更久），采用标准化的评分系统（如Draize评分系统）观察并记录角膜、虹膜和结膜组织的损伤反应（如浑浊度、炎症、水肿、分泌物）。通过量化损伤程度并观察损伤随时间的变化趋势，评估受试物的眼刺激性或腐蚀性潜力。

四、伦理与动物福利

本试验涉及动物使用，严格遵守以下原则：

3R原则（替代、减少、优化）：优先考虑并探索应用非动物替代方法的可能性。仅在缺乏科学可靠的替代方法且必要时使用动物。试验设计确保使用最少数量的动物获得可靠数据。不断优化试验程序以减轻动物痛苦。
人道终点：预先设定严格的安乐死标准（如严重角膜溃疡、穿孔、角膜浑浊导致失明、严重痛苦且无恢复迹象）。一旦动物表现出不可逆的痛苦或达到人道终点，立即施行安乐死。
动物关怀：试验动物饲养在符合标准的设施中，保障其健康福利。试验操作由训练有素的人员执行，最大限度减轻操作本身带来的不适。
伦理审查：试验方案必须经过机构动物伦理委员会的审查和批准。

五、试验材料与方法

受试物：
- 状态： 明确记录受试物理化状态（液态、固态、糊状、粉末、气溶胶等）。
- 制备： 液态受试物通常直接使用原液。固态或粉末状受试物，若预期使用方式可能入眼（如眼影飞粉），需按规定研磨并用合适溶剂（首选生理盐水或蒸馏水）配制成适当浓度的溶液或混悬液，并说明溶剂性质。需记录受试物的理化特性（如pH值、渗透压）。
- 标识： 清晰标记受试物信息及配制信息（如适用）。
实验动物：
- 物种： 首选健康成年白化家兔 (通常为新西兰白兔)。
- 数量： 根据预试验或受试物性质，通常起点为3只可评判动物。若结果模棱两可或预期刺激性低，可能需增加动物数量（如6只）。需确保有足够数量进行清晰的危害识别。
- 选择标准： 体重适宜（通常2.0 - 3.5 kg），眼睛健康无炎症损伤（使用荧光素钠检查确认角膜完整性）。试验前动物应有充足的适应期（至少5天）。
- 饲养管理： 动物单笼饲养，提供标准饮食、清洁饮水及合适环境（温度、湿度、光照周期）。
试验前准备：
- 动物试验前需禁食（自由饮水）。
- 轻柔固定动物，避免不必要的应激。
- 再次检查双眼健康状况，确保对照眼正常。
染毒步骤：
- 方法： 轻柔拉开家兔下眼睑，形成结膜囊。使用精准移液器或微量注射器，将0.1毫升液态受试物或等量（约100毫克） 固体/粉末/糊状受试物，滴入/涂敷于一只眼睛（试验眼） 的结膜囊中部。避免器械接触角膜。
- 对照： 另一只眼睛不处理，作为同期对照。
- 染毒后处理： 染毒后立即轻轻合拢眼睑数秒，使受试物均匀分布。除非有科学依据支持模拟实际暴露场景（如家用清洁剂溅入眼后立即冲洗），否则通常不冲洗眼睛（“非冲洗”模式）。若需模拟冲洗场景（“冲洗”模式），必须在染毒后指定时间（如30秒）使用足量生理盐水或清水冲洗规定时间（如30秒），并需在报告中明确说明理由和方法。
临床观察与评分：
- 时间点： 通常在染毒后1小时、24小时、48小时、72小时进行检查。根据损伤情况，持续观察至第7天或第21天，或直至所有可逆性损伤完全恢复或达到人道终点。若72小时时损伤严重或仍在进展，观察期需延长。
- 方法： 每次检查需在适宜光源下进行（推荐裂隙灯生物显微镜）。必要时使用荧光素钠染色检查角膜损伤（染毒后24小时及之后检查时使用）。
- 观察指标与评分： 采用标准评分系统（如修改后的Draize评分系统）对以下部位进行独立评分：
  - 角膜： 浑浊度（Opacity）及其累及范围（Area）。评分基于浑浊程度（0-4分）与累及面积（0-4分）的乘积（最高16分）。
  - 虹膜： 炎症反应（充血、肿胀、对光反射消失等）（0-2分）。
  - 结膜： 发红（充血、Chemosis）（0-3分）、肿胀（水肿）（0-4分）、分泌物（0-3分）。
- 记录： 详细记录每只动物在每个观察时间点各眼部结构的评分值、损伤的详细描述（性质、部位、程度）、任何全身毒性体征及动物行为变化。拍摄高质量照片存档。
人道终点与安乐死：
- 一旦动物出现严重不可逆损伤（如深度角膜溃疡穿孔、角膜浑浊导致失明、严重坏死）或持续剧烈疼痛（表现为畏光、闭眼、摩擦眼睛、食欲废绝、精神极度沉郁），判断其已达人道终点，应立即施行安乐死（如静脉注射过量的巴比妥类药物）。
- 试验结束后，所有生存动物均应以人道方式实施安乐死。

六、结果判定

个体动物结果： 综合各观察时间点的评分（特别是角膜、虹膜、结膜损伤的峰值和持续时间）以及损伤的可逆性/不可逆性。
整体试验结果判定： 基于所有可评判动物在关键时间点（如24、48、72小时）的反应：
- 腐蚀性： 通常在染毒后14天内，角膜、结膜或虹膜出现坏死、显著组织脱落、出血；或角膜浑浊、虹膜炎、结膜炎在染毒后21天内未完全恢复至染毒前水平。通常表现为不可逆的组织损伤。
- 严重眼刺激性： 眼部组织产生显著损伤（如角膜浑浊、虹膜炎、结膜水肿/充血），且这些损伤在染毒后21天内未完全恢复。
- 眼刺激性： 眼部组织产生可观察到的变化（如结膜充血、水肿、角膜轻微浑浊），这些变化在染毒后21天内基本或完全恢复。
- 无刺激性： 在观察期内未引起眼部组织的明显变化。
分类标准： 结果判定需参照相关的全球化学品统一分类和标签制度(GHS)或特定地区的法规（如中国《化妆品分类规则和分类目录》）中的眼刺激/腐蚀分类标准进行最终危害分类（类别1/类别1A/类别1B/类别2/无分类）。

七、试验报告

报告应详尽、透明，至少包括：

受试物详细信息（理化特性、配制方法）。
实验动物信息（物种、品系、来源、数量、性别、体重范围、饲养条件）。
试验依据标准（如OECD TG 405）。
详细试验方法（染毒剂量、体积/重量、染毒方式、冲洗与否及细节、观察时间点）。
每只动物的原始数据（各时间点各部位详细评分、描述性观察记录、照片记录）。
每只动物损伤随时间变化的总结及可逆性评估。
整体试验结果判定及其依据（包括适用分类）。
任何偏离试验方案的说明及其合理性。
动物福利执行情况（包括安乐死信息）。
结论。

八、体外替代方法的发展与应用

由于动物福利关切和科学技术的进步，完全替代动物试验的体外眼刺激/腐蚀性替代方法正快速发展并被法规接受：

腐蚀性筛选：
- 基于受试物极端pH或强酸/强碱缓冲能力。
- 基于膜屏障完整性破坏的测试（如Corrositex®、大鼠皮肤经皮电阻试验TER的衍生应用）。
刺激性评估：
- 重建人角膜上皮模型(RhCE)： 如EpiOcular™ ET-50、SkinEthic™ HCE、LabCyte CORNEA-MODEL等。通过测量细胞活力（MTT/XTT转化或类似方法）判断化学品是否达到刺激性阈值。
- 鸡胚绒毛尿囊膜试验(CAM-based tests)： 如HET-CAM、CAM-TB，通过观察CAM血管损伤（出血、凝血、血管溶解）评估刺激性。
- 使用牛角膜浑浊和渗透性试验(BCOP) 评估引起角膜浑浊和屏障破坏的物质。
- 荧光素渗漏试验(FLT) 评估对细胞屏障功能的影响。
组合策略(IATA)： 结合多种体外方法的测试策略，覆盖更广的生物终点，提供更可靠的刺激性分级（如区分严重刺激/中等刺激/无刺激）。
法规接受度： 许多替代方法（如多个RhCE方法、BCOP、某些CAM试验）已被OECD采纳为测试指南，并被欧盟、中国等地区的化妆品法规接受用于特定范围的化妆品原料或产品的眼刺激安全性评估，特别是用于排除严重刺激/腐蚀性物质。对于复杂混合物或极端理化性质的物质，应用仍有限制。
未来方向： 开发更能模拟人类复杂眼部反应的先进模型（如含神经、免疫细胞的三维模型），改进组合策略以覆盖所有分类终点，是当前主要研究方向。

九、结论

急性眼刺激性/腐蚀性试验是评估化妆品眼部安全性的重要工具。严格遵循标准化操作流程、秉持最高的动物伦理标准并详细记录观察结果，是获得可靠科学数据的基础。随着科学进步，基于3R原则的体外替代方法正逐步取代动物试验，成为全球化妆品安全评估的主流趋势。化妆品研发应积极采纳经过验证的体外方法，在保障消费者安全的同时，推动更加人道和科学的测试范式。持续优化试验策略与积极采纳替代方法，是实现化妆品安全与人道科学双重目标的核心路径。