化妆品多次皮肤刺激性/腐蚀性试验

化妆品多次皮肤刺激性/腐蚀性试验：原理、方法与评估

摘要： 本文系统阐述了化妆品多次皮肤刺激性/腐蚀性试验的目的、原理、主要方法（体外重建人表皮模型法）、试验程序、结果解读及其在化妆品安全评估中的核心作用，强调了该试验对于保障消费者皮肤健康、满足法规要求的重要性。

一、 引言

化妆品作为与皮肤长期、频繁接触的产品，其安全性至关重要。反复使用可能导致皮肤刺激甚至腐蚀作用，单次暴露试验（如急性皮肤刺激性试验）无法充分评估此类风险。多次皮肤刺激性/腐蚀性试验旨在模拟产品在实际使用条件下（连续数天重复涂抹），评估其诱发可逆性炎症（刺激）或不可逆性组织损伤（腐蚀） 的潜在能力，是化妆品安全评价体系的关键环节。随着体外替代方法的成熟与法规认可，基于重建人表皮模型的体外方法已成为主流。

二、 试验目的

1. 预测长期风险： 评估化妆品或其成分在重复使用后是否可能引起累积性的皮肤刺激反应（如红斑、水肿）或腐蚀性损伤。
2. 安全性分级： 为产品安全使用提供依据（如适用频率、适用人群警示）。
3. 配方优化： 指导改良配方，降低潜在刺激性。
4. 法规符合性： 满足国内外主要化妆品法规对产品安全性的强制性测试要求（如欧盟化妆品法规(EC) No 1223/2009，中国《化妆品安全技术规范》）。

三、 核心试验方法：体外重建人表皮模型法 (OECD TG 439)

目前国际上广泛采用且被经济合作与发展组织(OECD)指南439认可的方法是使用体外重建人表皮模型。

• 模型基础：

  • 来源于人皮肤角质形成细胞，在气液界面培养分化形成具有多层结构（基底层、棘层、颗粒层、角质层）的类表皮组织。
  • 形态学、生物化学和功能特性（如屏障功能）高度模拟人体表皮。
  • 商业化模型需具备良好重现性和标准化质量（如屏障功能完整、代谢活性稳定）。

• 试验原理： 将受试物重复应用于模型表面，模拟产品实际使用频率。通过检测暴露后模型的细胞活性（通常用MTT法等测定）和形态学变化，量化组织损伤程度，以此预测其对人体的刺激性/腐蚀性潜力。细胞活性下降程度是判断刺激/腐蚀性的核心指标。

四、 标准试验程序（简述）

1. 模型准备与质检： 选用合格批次的重建表皮模型，使用前在培养箱中平衡，确认其生存力（通常要求>90%）。
2. 受试物准备： 化妆品成品、原料或混合物。根据产品性状（固体、液体、膏霜、粉末）按指南要求进行适当处理（如稀释、溶解）。设置溶剂/赋形剂对照和阳性对照（如月桂基硫酸钠水溶液）。
3. 暴露方案（关键）：
   • 频率： 通常为连续 5天（模拟一周工作日使用）。部分情况下可根据预期使用频率调整（如染发剂）。
   • 剂量： 受试物以规定剂量（如固体约10-20mg/cm²，液体约15-30μL/cm²）均匀涂抹于模型表面。
   • 处理： 每次暴露持续 42±1分钟 (模拟产品在皮肤上的短暂停留)。暴露后，严格清洗去除残留受试物（模拟日常清洁）。
   • 培养： 清洗后的模型放回新鲜培养基中继续培养至下一次暴露或试验终点。
   • 重复： 上述过程在第1、2、3、4、5天重复进行。
4. 终点检测（第6天）：
   • 细胞活力测定 (MTT法)：
     • 孵育MTT试剂：模型与MTT溶液孵育约3小时，活细胞线粒体酶还原MTT形成紫色甲臜(formazan)结晶。
     • 萃取溶解：异丙醇溶解结晶。
     • 定量分析：测量萃取液在特定波长（如570nm）下的光密度(OD值)。
     • 计算相对细胞活性(%)： （受试物组OD均值 / 对照组OD均值） × 100%。
   • 组织学评估（可选但推荐）：
     • 试验结束时固定模型样本。
     • 切片、H&E染色。
     • 显微镜下观察组织形态学变化（如细胞空泡化、坏死、细胞层脱离、角质层破坏），提供细胞活性数据外的补充信息，尤其有助于区分刺激性与腐蚀性损伤模式（腐蚀通常伴随更严重的结构破坏）。
5. 质量控制：
   • 阳性对照必须引起显著的细胞活性下降（通常在预期范围内）。
   • 阴性/溶剂对照的细胞活性应保持高水平（通常>90%）。
   • 模型自身生存力合格。
   • 试验需在符合GLP原则（良好实验室规范）的实验室进行（法规测试强制要求）。

五、 结果解读与分类

根据OECD TG 439标准：

1. 细胞活性阈值：

   • 腐蚀性预测： 如果暴露结束（第6天）时，平均相对细胞活性 ≤ 15%，且该效应在清洗后培养期间不可逆（通常可通过第3天或第4天的活性初步判断趋势），可预测该物质具有皮肤腐蚀性。
   • 非腐蚀性判定： 如果平均相对细胞活性 > 15%，则预测该物质无腐蚀性。

2. 刺激性分级（基于细胞活性下降程度）：

   • 通常在得出“无腐蚀性”结论后，进一步评估刺激性潜力：
     • 无刺激性预测： 平均相对细胞活性 ≥ 70% (或 ≥ 50%，取决于具体应用要求和历史数据)。
     • 轻度-中度刺激性预测： 平均相对细胞活性介于 50%（或40%）至 70% 之间。
     • 中度-重度刺激性预测： 平均相对细胞活性 < 50%（或40%）。
   • 注意： 具体的刺激性分级阈值可能因实验室内部验证、监管机构具体要求或产品类型（如淋洗类vs驻留类）而略有差异，需结合组织学观察综合判断。组织学证据能显著提高判断准确性，例如显示炎症细胞浸润、显著海绵水肿支持刺激性判断；显示大面积坏死、表皮完全解离则支持腐蚀性判断。

六、 试验在安全评估中的应用与局限性

• 应用：

  • 安全决策核心依据： 结果是判断产品是否可安全上市、确定标签警示语（如“可能引起刺激”）的关键科学依据。
  • 风险评估基石： 结合人体斑贴试验（如重复刺激斑贴试验(RIPT)）结果、产品使用部位、频率、时长、消费者群体特征（如敏感肌肤）进行全面的暴露风险评估。
  • 原料筛选： 用于筛选新原料或评估替代原料的刺激性潜力。
  • 宣称支持： 为“低刺激性”、“适用于敏感肌肤”等宣称提供支持数据（通常需结合人体试验）。

• 局限性：

  • 体外模型差异： 不同来源的商业模型在屏障特性、代谢能力上存在差异，可能影响结果。
  • 复杂配方挑战： 对于成分复杂、含挥发性物质、高粘度或特殊剂型（如喷雾、粉状）产品，标准化应用和清洗可能存在挑战。
  • 免疫反应缺失： 体外模型缺乏完整的免疫系统，无法评估致敏性或免疫介导的炎症反应（需通过其他试验如OECD TG 442系列评估）。
  • 主观症状无法模拟： 无法模拟刺痛、灼烧感等主观症状。
  • 仍需人体数据验证： 体外数据是重要的预测工具，但最终产品的安全性确认常需结合精心设计的人体试用试验。

七、 结论

多次皮肤刺激性/腐蚀性体外试验（主要依据OECD TG 439），利用先进的重建人表皮模型技术，有效地模拟了化妆品重复使用对皮肤的影响，为预测产品潜在的累积性皮肤损伤风险提供了可靠、标准化且符合伦理（非动物）的科学方法。准确解读细胞活性和组织学数据，结合暴露场景进行全面的风险评估，是确保化妆品在使用条件下对消费者皮肤安全的至关重要的步骤。该试验是化妆品安全评价体系中不可或缺的组成部分，其广泛应用显著推动了化妆品行业的安全生产和消费者保护。

（注：本文内容依据现行国际标准（OECD TG 439）撰写，实际试验操作应严格遵循最新版指南及实验室标准操作规程，并符合产品上市地区的具体法规要求。国内试验需遵循《化妆品安全技术规范》相关规定。）