肥料及土壤调理剂经口毒性试验(限量法)技术指南
1. 目的与范围 本指南旨在规范肥料及土壤调理剂（以下简称“供试品”）的经口急性毒性试验程序，采用限量法（Limit Test）评估其在一次性经口暴露下的潜在急性毒性风险，为产品安全性评价与分类提供依据。适用于需进行毒理学安全评估的新型肥料及土壤调理剂。
2. 规范性引用文件 试验设计遵循化学品毒理学评价通用原则，参考国际认可的标准方法（如OECD Guideline 425），并符合国内化学品登记及肥料管理相关要求中对急性经口毒性数据的规定。
3. 试验原理（限量法） 限量法是一种简化的急性毒性测试方法。设定一个较高剂量水平（通常为5000 mg/kg体重）作为试验上限剂量。若在此剂量下供试品未引起试验动物死亡，则认为其急性经口毒性较低，无需进一步测试更高剂量。反之，若出现动物死亡，则需采用更精确方法（如上下法）测定半数致死量（LD₅₀）。
4. 试验材料
- 4.1 试验动物:
- 种类: 首选健康成年大鼠（Sprague-Dawley或Wistar品系）。若不适合，可使用其他啮齿类动物，需说明理由。
- 体重与年龄: 年轻成年动物，体重范围明确（如大鼠170-200g），同次试验体重差异不超过±20%。
- 性别: 通常使用单一性别（首选雌性，因其对某些化学物更敏感）或雌雄各半，每组至少5只动物。需说明选择依据。
- 来源与检疫: 合格供应商提供，实验前检疫适应至少5天，观察健康状况。
- 4.2 供试品:
- 提供详细理化性质（形态、颜色、气味、pH值、溶解度等）。
- 试验前按要求配制。水溶性供试品可用蒸馏水或生理盐水溶解/悬浮；难溶性可选用适当无毒溶剂或助悬剂（如羧甲基纤维素钠溶液、食用植物油），需设溶剂对照组。
- 混悬液或乳液应保证给药前充分混匀。
- 4.3 主要仪器设备:
- 精密电子天平
- 灌胃针（软质套管，大小适配动物体重）
- 动物秤
- 饲养笼具（符合实验动物福利标准）
- 生化指标检测设备（如必要时）
- 解剖器械（如必要时）
5. 试验方法
- 5.1 剂量设定:
- 限量剂量: 固定为 5000 mg/kg 体重。
- 对照组: 设立溶剂/赋形剂对照组（若使用）和空白对照组（仅使用灌胃用水或生理盐水）。
- 5.2 动物分组与标记:
- 将试验动物随机分为限量剂量组和对照组。
- 动物个体清晰标记（耳标、染色等）。
- 5.3 给药:
- 途径: 经口灌胃。
- 方法:
- 给药前动物禁食过夜（约16小时），自由饮水。
- 准确称量动物体重。
- 根据体重计算给药体积（通常不超过1mL/100g体重）。
- 使用适当型号灌胃针，轻柔、准确地将供试品溶液/混悬液一次性灌入动物胃内。确保药液未进入呼吸道。
- 给药后约4小时恢复供食、供水。
- 5.4 观察期:
- 主要观察期: 给药后至少严密观察 14天。
- 关键期: 给药后最初 24-48小时 需高频次观察动物状态。
- 5.5 观察指标:
- 临床表现: 每日至少两次详细观察并记录：
- 皮肤、被毛、眼、粘膜变化
- 呼吸状态、循环功能（鼻、尾颜色）
- 自主神经系统症状（流泪、流涎、竖毛、瞳孔大小等）
- 中枢神经系统症状（嗜睡、震颤、抽搐、痉挛、共济失调、反常行为等）
- 胃肠系统症状（腹泻、便秘等）
- 动物死亡时间
- 体重变化: 给药当天、给药后第7天和第14天称重，记录体重变化。
- 死亡率: 记录每日死亡动物数及时间。
- 病理检查: 所有死亡动物及时解剖，肉眼观察主要脏器（心、肝、脾、肺、肾、胃肠、脑等）病变情况。试验结束时所有存活动物亦应解剖检查，异常组织需进行病理组织学检查。
- 临床表现: 每日至少两次详细观察并记录：
6. 数据处理与结果判定
- 6.1 数据记录:
- 详细记录所有原始数据：动物编号、性别、体重、给药剂量、给药体积、给药时间、所有观察期的症状表现（出现时间、持续时间和严重程度）、死亡时间（若有）、各时间点体重、解剖所见。
- 6.2 限量法结果判定:
- 限量无毒: 试验期间，限量剂量组（5000 mg/kg）动物 未出现死亡。据此可判定该供试品的急性经口LD₅₀大于5000 mg/kg体重。试验结束。
- 限量有毒:
- 限量剂量组动物 出现死亡（无论死亡数量）。
- 限量剂量组动物虽未死亡，但观察到 严重、持续且可归因于供试品的毒性症状。
- 在上述任一情况下，均判定为限量法试验呈阳性（即供试品在5000 mg/kg剂量下显示急性经口毒性）。此时，需要采用精确测定LD₅₀的方法（如上下法或固定剂量法）进一步评估该供试品的急性经口毒性。
7. 试验报告 报告应清晰、完整、客观地包含以下信息：
- 供试品名称、状态、理化性质、配制方法（溶剂/助悬剂及浓度）。
- 试验动物信息（种属、品系、来源、性别、数量、体重范围、检疫情况）。
- 试验条件（实验室环境、温度、湿度、光照周期、饲料、饮水）。
- 试验方法详述（限量法原理、剂量设定依据、给药途径、体积、时间、观察期限）。
- 详细观察结果：
- 所有动物的临床症状（按日期、时间记录）。
- 体重数据（以表格形式呈现个体和均值±标准差）。
- 死亡动物数和死亡时间。
- 解剖所见（肉眼观察结果及病理组织学检查结果，若有）。
- 结果判定：明确说明是否符合限量无毒判定标准。
- 结论：明确供试品的急性经口毒性类别（如LD₅₀ > 5000 mg/kg）或说明需进一步测试。
8. 试验质量控制与伦理要求
- 动物福利: 试验过程遵循“减少、优化、替代”（3R）原则。所有操作应最大限度地减少动物痛苦。人道终点标准明确，发现濒死或遭受不可逆转痛苦的动物应及时安乐死。试验方案需经机构动物伦理委员会（IACUC）审查批准。
- 人员安全: 操作人员需经过培训，熟悉供试品潜在危害及安全数据单（SDS）。接触供试品时佩戴个人防护装备（实验服、手套、护目镜等）。实验室配备急救设施。
- 数据可靠性: 确保原始记录准确、清晰、可追溯。试验操作和观察记录由经过培训的人员完成。
9. 应用说明
- 限量法核心价值: 作为初步筛选手段，高效识别急性经口毒性低的物质（LD₅₀ > 5000 mg/kg），避免不必要的动物消耗和精确LD₅₀测试。
- 结果应用: 限量无毒结果为肥料及土壤调理剂的安全性评价提供关键依据，常用于产品登记、风险评估和安全分级（通常归为低毒或实际无毒类别）。
- 局限性: 限量法无法提供精确的LD₅₀值。若限量法结果为阳性，必须借助其他方法确定毒性强度和分级。
10. 注意事项
- 供试品配制应确保均匀稳定，给药浓度和体积准确计算。
- 灌胃操作熟练轻柔，避免造成机械性损伤。
- 观察要细致、客观、及时，尤其关注给药后关键时间窗。
- 严格遵守动物实验伦理规范和生物安全规定。
- 试验报告应完整、透明，包含支持结论的所有关键信息。
本指南提供了一种标准化方法来评估肥料及土壤调理剂的急性经口毒性潜力，为保障农产品安全与环境健康提供科学依据。实施中应始终贯彻动物福利与实验室安全原则。