微生物肥料急性经口毒性试验(限量法) - 中析研究所生物检测中心

微生物肥料急性经口毒性试验（限量法）技术规程

一、目的 本试验旨在评估一次性经口途径给予实验动物受试微生物肥料后，观察其短期（14天内）产生的毒性效应，并根据死亡率判定其急性毒性分级，为微生物肥料的生产、运输、储存及使用安全提供毒理学依据。

二、原理 限量法（Limit Test）适用于预期毒性较低或实际无毒的物质测试。根据预先设定的最大允许给药剂量（限量剂量），一次性灌胃给予实验动物受试物。在规定观察期内，若无动物死亡，可判定该受试物在该途径（经口）下的急性毒性LD₅₀大于限量剂量，通常可归类为实际无毒或微毒级别。对于微生物肥料，因其主要成分为特定功能的活性微生物及其代谢产物，预期具有较低的急性经口毒性风险，故常采用本法进行初步评估。

三、试验材料

受试物： 待测微生物肥料样品。应提供样品名称、基本理化性质（形态、颜色、气味、pH值等）、主要功能菌种（属/种）信息、生产批号及保存条件。试验前需混匀，必要时可加入适量蒸馏水或生理盐水调配成均匀、稳定的混悬液或溶液（避免灭菌处理破坏微生物组分）。
实验动物：
- 种属： 首选健康初成年Sprague-Dawley (SD) 或 Wistar品系大鼠。亦可使用小鼠（如ICR、KM品系）。
- 性别： 通常使用单一性别（雌性或雄性），或雌雄各半。若仅用一种性别，需说明理由。
- 体重： 大鼠体重范围通常为180-220g，小鼠为18-22g。同一批试验动物体重差异不应超过平均体重的±20%。
- 数量： 每个剂量组动物数不少于5只。
- 来源与检疫： 动物应来源于具有实验动物生产许可证的单位，合格证齐全。试验前在标准化实验室环境中适应性饲养至少5天，观察健康状况，剔除异常动物。
主要试剂与器具：
- 蒸馏水或生理盐水（用于样品稀释）。
- 灌胃针（大小型号需匹配动物体重）。
- 电子天平、混匀器。
- 动物体重秤、记号笔。
- 标准动物笼具、垫料、饲料、饮水瓶。
- 解剖器械（备用）。
- 个体动物试验记录表。

四、试验步骤

样品制备：
- 取足量代表性微生物肥料样品。
- 根据受试物形态（粉剂、颗粒、液体）和限量剂量要求，用蒸馏水或生理盐水配制或稀释成所需浓度的混悬液或溶液（通常目标剂量为5g/kg BW或5000mg/kg BW）。浓度需确保能在合理体积内（大鼠通常不超过1mL/100g BW，小鼠不超过0.4mL/20g BW）达到限量剂量。
- 充分混匀，避免分层。现用现配（尤其含活菌样品）。
限量剂量设定：
- 根据相关标准（如GB/T 31270.1-2014《化学农药登记毒理学试验方法第1部分：急性经口毒性试验》）或产品安全性预期，设定最大限量剂量。微生物肥料急性经口毒性试验普遍采用5g/kg BW（5000mg/kg BW）作为限量剂量。
动物分组与标记：
- 将检疫合格的动物随机分为两组：
  - 受试物组： 给予配制好的微生物肥料样品（目标剂量为限量剂量）。
  - 溶剂/赋形剂对照组： 给予与受试物组等体积的配制样品所用的溶剂（蒸馏水或生理盐水）。此组必不可少，用于排除载体溶剂本身的影响。
- 每组动物数≥5只。
- 个体动物标记（如耳标、染色）。
禁食与称重：
- 给药前动物禁食过夜（通常16±2小时，自由饮水）。
- 给药前准确称量每只动物体重，精确至0.1g（大鼠）或0.01g（小鼠）。
- 根据体重和限量剂量计算每只动物所需的给药体积（mL）= 限量剂量（g/kg BW或 mg/kg BW） × 动物体重（kg） / 样品配制浓度（g/mL 或 mg/mL）。
给药：
- 采用一次性经口灌胃法。
- 使用合适型号的灌胃针，沿动物口腔一侧缓慢插入食道至预定深度（大鼠约3-4cm，小鼠约1.5-2cm），注入计算好的样品体积或对照溶剂。
- 给药过程操作轻柔，避免损伤食道或误入气管。
- 给药后4小时内观察动物是否有呕吐（啮齿类罕见）、误吸等情况。若发生严重呕吐或误吸导致动物濒死，该动物数据应作废并注明原因，必要时补充动物。
给药后观察：
- 观察期： 至少连续观察14天。
- 详细观察记录： 每天至少观察两次（早、晚），尤其在给药后最初24小时内应增加观察频率（如给药后第1、2、4、8、24小时）。
- 观察指标应包括：
  - 动物死亡情况（记录具体死亡时间）。
  - 动物行为活动（是否正常、兴奋、抑制、嗜睡、震颤、抽搐、共济失调等）。
  - 呼吸状态（频率、深度）。
  - 被毛、眼、口、鼻（分泌物、颜色异常）。
  - 粪便性状（腹泻、便秘、血便）。
  - 其他中毒症状（如流泪、流涎、竖毛、眼睑下垂等）。
- 体重监测： 给药当天（给药前）、给药后第7天和第14天（或试验结束时）对所有存活动物称重，记录体重变化。
- 濒死动物处理： 发现濒死动物应立即实施安乐死（如颈椎脱臼或吸入麻醉剂），并记录时间视为当日死亡。死亡动物及时解剖，肉眼观察主要脏器（心、肝、脾、肺、肾、脑、胃肠等）有无明显充血、出血、水肿、坏死等病理性改变（不做组织病理学检查）。解剖发现记录在案。

五、结果判定

主要判定依据：
- 14天内动物存活情况（死亡率）。
- 中毒症状出现时间、性质、严重程度、持续时间及恢复情况。
- 体重变化。
限量法判定标准：
- 无死亡： 若受试物组在14天观察期内无动物死亡（存活率100%），且对照组也无动物死亡（排除非受试物因素致死），则表明该微生物肥料在经口途径下的LD₅₀ > 5000mg/kg BW（或 > 5g/kg BW）。
- 有死亡： 若受试物组在14天观察期内有动物死亡（无论死亡数量），则表明该微生物肥料在该限量剂量（5000mg/kg BW 或 5g/kg BW）下产生了致死毒性，需要进一步采用常规LD₅₀测定法（递减剂量法或多剂量法）精确测定其LD₅₀值及其95%置信区间。
毒性分级（参考）： 根据LD₅₀估计值可进行毒性分级（下表为常用分级标准之一）：

(注：此表为通用分级示例，实际应用中应遵循具体国家/地区的准则或标准)
- 根据限量法结果（无死亡）： 可判定LD₅₀ > 5000mg/kg BW，属于微毒/实际无毒（V级）。
- 根据限量法结果（有死亡）： 需待精确LD₅₀测定完成后，根据实测值按上表分级。

六、试验报告 试验报告应清晰、完整地包含以下信息：

受试物信息（名称、性状、主要成分说明）。
试验依据标准（如参考国家标准或指南）。
试验目的。
试验材料与方法：
- 动物种属、品系、性别、体重范围、数量、来源、检疫条件。
- 受试物配制方法（溶剂、浓度）。
- 试验设计（限量剂量值、对照组设置）。
- 给药途径、体积、时间。
- 观察期、观察指标及频率。
- 数据处理方法。
试验结果：
- 动物死亡情况（按组别、性别列表显示给药后死亡时间、死亡数/总数）。
- 中毒症状描述（症状类型、出现时间、持续时间、恢复情况）。
- 体重变化数据（列表显示每组动物平均体重及体重变化）。
- 解剖观察结果（若有）。
结果判定： 明确说明微生物肥料样品的急性经口毒性LD₅₀是否大于限量剂量（5000mg/kg BW或5g/kg BW），并根据判定给出毒性分级（如实际无毒级）。
结论：简明扼要地总结试验结果和毒性评价结论。
试验起止日期、试验地点。
试验操作者、负责人签名。

七、注意事项

生物安全： 微生物肥料可能含有活菌（即使是菌剂载体也可能含未知微生物）。试验操作（特别是样品处理、灌胃、解剖）应在生物安全柜或适宜防护设施下进行，操作人员需佩戴个人防护装备（口罩、手套、实验服），严格遵守生物安全规程。废弃物应按微生物污染物处理。
样品代表性： 确保受试样品具有生产和使用的代表性。
样品稀释： 稀释样品所用的溶剂（水或生理盐水）不应含有任何可能干扰试验结果的物质。稀释后样品应保持稳定、均一、灌胃可行。
动物福利： 严格遵守实验动物伦理规范和“3R”原则（替代、减少、优化）。动物饲养条件应符合国家标准（GB 14925），提供充足清洁的饮水和饲料（除禁食时段）。试验过程中尽可能减轻动物痛苦，对濒死或遭受严重痛苦的动物及时实施人道终点（安乐死）。试验方案应经实验动物伦理委员会审查批准。
对照组设置： 溶剂/赋形剂对照组是试验有效性的关键，必须设置且动物数不少于受试物组。
给药准确性： 精确计算给药体积，确保每只动物接受的剂量准确。避免灌胃操作不当导致动物损伤或给药失败。
观察严谨性： 观察应细致、客观、及时、完整记录。特别注意给药后初期（24小时内）动物的反应。
结果解释： 急性经口毒性试验仅反映一次性暴露的短期效应。微生物肥料的安全性还需结合皮肤刺激/腐蚀性、眼刺激/腐蚀性、致敏性、多次给毒毒性、致病性、残留、环境行为等多方面数据进行全面评价。
法规符合性： 试验实施应遵循国家或地区关于肥料登记、化学品安全评价等相关法规和标准要求（如GB/T 31270.1）。

总结本规程详细描述了微生物肥料急性经口毒性限量法试验的操作流程与判定标准。通过给予实验动物最大限量剂量（通常为5g/kg BW）的受试物，观察14天内动物的死亡情况和中毒症状。若受试物组动物无死亡，且对照组动物也无死亡，则可判定该微生物肥料急性经口毒性LD₅₀ > 5000mg/kg BW，属实际无毒级。此法高效、经济，适用于预期低毒性的微生物肥料产品的初步安全评估。试验须严格遵循生物安全规范、动物伦理要求和标准操作规程，以确保结果的科学性和可靠性。