化学品皮肤致敏试验 - 中析研究所生物检测中心

化学品皮肤致敏试验：方法与策略

化学品皮肤致敏（过敏性接触性皮炎）是常见的职业与环境健康问题，指皮肤反复接触特定化学物质后引发的迟发型超敏反应。准确评估化学品的皮肤致敏潜力至关重要，这关系到工人安全防护、消费者产品风险评估及环境保护。当前的评估策略已从严重依赖动物实验转向更先进、更符合伦理的综合性方法。

一、传统体内试验（动物实验）

豚鼠最大化试验 (GPMT)
- 原理： 通过皮内注射佐剂和受试物（诱导阶段）增强免疫反应，间隔约一周后，在未处理部位涂抹较低浓度受试物（激发阶段），观察红斑、水肿等皮肤反应。
- 标准遵循： OECD TG 406 等。
- 优点： 历史悠久，数据丰富，被认为是“金标准”。
- 缺点： 使用动物、实验周期长、成本高、存在主观评分误差、疼痛与不适。
豚鼠封闭斑贴试验 (Buehler Test)
- 原理： 采用封闭斑贴方式将受试物涂抹于皮肤（诱导阶段），反复多次后进行激发，观察局部皮肤反应。
- 标准遵循： OECD TG 406。
- 优点： 相较于GPMT痛苦略低。
- 缺点： 灵敏度通常低于GPMT，仍需使用动物，周期长。

二、替代体内试验（减少/优化动物使用）

小鼠局部淋巴结试验 (LLNA)
- 原理： 将受试物涂抹于小鼠耳背（诱导阶段），敏感个体淋巴结细胞会活化增殖。通过测量淋巴结细胞增殖程度（通常使用放射性胸腺嘧啶核苷掺入法或非放射性替代方法）来量化致敏潜力。“刺激指数” (SI) >= 3通常判为阳性。
- 标准遵循： OECD TG 429， TG 442A (放射性)， TG 442B (非放射性，如BrdU-ELISA)。
- 优点： 动物使用显著减少（每组通常只需4只动物），客观定量（减少主观性），缩短实验周期（约1周），可提供剂量-反应关系信息。
- 缺点： 仍使用动物，某些刺激物/腐蚀物可能产生假阳性结果，皮肤反应信息有限。

三、体外替代方法（非动物方法）

这些方法基于致敏关键事件（KE），旨在模拟皮肤致敏的生物学机制：

关键事件1：亲电物质与皮肤蛋白形成共价结合（致敏原必备属性）
- 直接肽反应性试验 (DPRA)： OECD TG 442C
  - 原理： 在体外测试化学品与模型肽（含半胱氨酸或赖氨酸）的共价结合能力。
  - 应用： 识别亲电性化学物质（致敏原的共同特征）。
- 氨基酸衍生物反应性试验 (ADRA)： OECD TG 442D
  - 原理： 利用荧光标记的氨基酸衍生物（半胱氨酸、赖氨酸衍生物），通过HPLC测定受试物与其反应导致的荧光损失。
  - 应用： 更精确量化肽反应性，克服DPRA中某些物质的溶解度问题。
关键事件2：角质形成细胞激活 - 皮肤炎症信号启动
- ARE-Nrf2 荧光素酶试验 (KeratinoSens™ / LuSens)： OECD TG 442D
  - 原理： 利用转基因人角质形成细胞系，检测受试物是否能激活ARE通路（抗氧化反应元件），诱导荧光素酶报告基因表达。
  - 应用： 识别能激活角质形成细胞炎症/应激通路的致敏物。
- 人细胞系活化试验 (h-CLAT)： OECD TG 442E
  - 原理： 使用人单核细胞系THP-1或U937，检测受试物处理后细胞表面CD86和CD54表达量的增加（流式细胞术检测）。
  - 应用： 评估化学物质激活树突状细胞关键标志物（抗原呈递细胞成熟）的能力。
- U937细胞系活化试验 (U-SENS™ / IL-8 Luc试验)： OECD TG 442E
  - 原理： 基于U937细胞系，检测受试物诱导IL-8（关键趋化因子）产生的水平。
  - 应用： 评估激活树突状细胞样细胞的潜力。
关键事件3：树突状细胞激活
- h-CLAT 和 U-SENS™ / IL-8 Luc试验也覆盖此关键事件。

四、计算机预测方法

定量构效关系 (QSAR) / 专家规则系统
- 原理： 基于已知致敏物的化学结构特征（如反应性官能团、分子大小、亲脂性等），利用统计学或专家规则建立预测模型。
- 工具示例： Toxtree, VEGA, OECD QSAR Toolbox（包含皮肤致敏模块）。
- 应用： 快速筛查，对结构类似物预测较可靠。适用于化学品早期研发筛选。
- 局限性： 对新颖结构或复杂混合物预测能力有限，需谨慎解释结果。
基于知识的专家系统
- 原理： 整合化学机理、现有致敏数据、交叉参照（Read-Across）等方法进行综合评估。
- 应用： 在现有数据（自身或类似物）基础上进行更全面的证据权重评估。

五、综合风险评估策略

现代化学品皮肤致敏评估已不再单一依赖某种测试，而是采用整合测试与评估策略 (IATA) 或证据权重法 (WoE)：

信息收集与初步评估： 审查现有物理化学性质、人类数据、历史动物/体外数据、QSAR预测结果。
基于机理的层级测试：
- 第一步（识别危害）： 通常从体外方法开始（如DPRA/ADRA + KeratinoSens™/LuSens + h-CLAT/U-SENS™），组成“金三角”测试组合，覆盖关键事件。计算机预测（QSAR）可用于筛选或补充。
- 第二步（不确定性/复杂情况）： 若体外组合结果明确（如均为阴性或阳性），可下结论。若结果不一致、模棱两可、或化学类别复杂（如混合物、金属盐、聚合物），则可能需要补充体外测试或考虑进行LLNA（优化动物使用）甚至传统豚鼠试验以获得更确定的证据（需充分论证必要性）。
- 剂量-反应与风险评估： 利用LLNA剂量-反应数据或体外组合结果结合暴露评估信息进行风险表征（尤其在职业或消费者暴露场景中）。

结论

化学品皮肤致敏评估领域正经历显著变革。传统的动物实验（尤其是豚鼠法）正被更伦理、更高效、更基于机制的体外替代方法组合和计算机预测工具所替代。小鼠局部淋巴结试验 (LLNA) 作为重要的过渡方法，其使用也受到严格限制（需证明体外方法不可行）。最新的整合测试与评估策略 (IATA) 强调：