一次使用卫生用品多次皮肤刺激试验：原理、方法与评估
1. 引言
卫生用品（如湿巾、卫生巾、棉柔巾、面膜基布等）作为直接接触皮肤的产品，其安全性至关重要。皮肤刺激性是评价其安全性的核心指标之一。一次使用卫生用品多次皮肤刺激试验（Single-use Product, Multiple Applications Skin Irritation Test）是一种专门设计的动物实验方法，用于评估那些设计为单次使用，但在实际应用过程中可能与皮肤发生多次、间歇性接触的卫生用品，其成分或其浸提液对皮肤的潜在累积刺激作用。该方法是评估产品在重复暴露情境下安全风险的重要手段。
2. 试验目的
模拟产品在多次使用场景下对皮肤的可能影响，检测受试样品或其浸提液在多次涂敷后是否会引起皮肤红斑、水肿等可逆性炎症反应，从而预测其在预期用途条件下对人体皮肤产生刺激的可能性。
3. 试验原理
尽管产品设计为单次使用（如一片湿巾擦拭一次后丢弃），但在某些情况下，使用者可能使用同一片产品擦拭不同部位皮肤，或短时间内多次使用同类产品，导致皮肤部位可能间歇性地多次接触相似成分。本试验通过在实验动物（通常为健康家兔）的同一皮肤部位，进行为期数天的重复斑贴，模拟这种多次接触模式，观察是否产生累积刺激效应。
4. 试验材料与方法
- 4.1 试验动物：
- 通常选用健康的成年白色家兔（如新西兰白兔）。
- 动物数量：通常至少3只（考虑到个体差异，有时会使用更多）。
- 动物饲养：单笼饲养于符合标准的动物房环境中，提供充足食物饮水，遵循动物福利原则。
- 试验前准备：试验前至少24小时，在动物背部脊柱两侧选定区域（通常每侧各选2-3个），小心剃除或剪除被毛（避免损伤皮肤），备皮面积需满足斑贴要求（通常不小于2.5cm x 2.5cm）。
- 4.2 受试样品准备：
- 样品形式：
- 直接应用： 适用于本身具有一定湿润度且质地适合直接贴敷的产品（如湿巾、面膜布）。将样品剪成或准备成适当大小（通常不小于2.5cm x 2.5cm）。
- 浸提液应用： 适用于干性材料（如干棉柔巾、卫生巾表层）或需测试其可溶性成分刺激性的产品。将规定面积或重量的样品，在规定温度和时间下（如37±1°C下浸提24小时），用适当的溶剂（生理盐水或皮肤模拟汗液）浸提。浸提液需临用前新鲜制备或妥善保存。
- 对照样品： 同时设置阴性对照（生理盐水或溶剂）和阳性对照（已知的轻度刺激物，如1%十二烷基硫酸钠（SDS）水溶液）。
- 样品形式：
- 4.3 试验步骤：
- 第一次敷贴： 取适量受试样品（直接贴敷或饱和浸提液的惰性纱布/滤纸），紧密贴敷于动物背部一侧备妥的皮肤区域上（确保完全覆盖并接触皮肤），用半封闭性敷料（如透气胶带、纱布）固定。另一侧对应区域敷贴对照样品（阴性和/或阳性）。记录时间为“0小时”。
- 敷贴时间： 通常为4小时。
- 移除与观察： 4小时后小心移除敷贴物及样品。用温水或生理盐水轻柔清洗接触部位，去除残留物。在移除后约30-60分钟（让皮肤反应充分显现并排除机械压迫影响），进行首次皮肤反应观察并记录评分（见4.4）。此时间点记为“移除后立即观察”。
- 后续敷贴与观察： 在之后的连续3天或规定天数内（例如第2、3、4天），在同一个皮肤部位，严格按照第一次的操作重复进行敷贴（每次4小时）、移除、清洗和观察评分（同样在移除后30-60分钟评分）。
- 最终观察： 在最后一次敷贴移除并清洗后，除了“移除后立即观察”（通常在D4移除后30-60分钟），还需在最后一次敷贴移除后24小时（即D5）进行最终观察评分。这有助于观察刺激反应的消退或延迟反应。
- 4.4 皮肤反应观察与评分：
- 观察指标：主要观察红斑（Erythema） 和 水肿（Edema） 的形成情况。
- 评分标准：采用国际通用的Draize评分标准（或其等效标准）：
- 红斑和焦痂形成：
- 0分：无红斑
- 1分：轻微红斑（勉强可见）
- 2分：明显红斑（边界清晰）
- 3分：中度至重度红斑（鲜红色）
- 4分：严重红斑（紫红色）至轻微焦痂形成（深度损伤）
- 水肿形成：
- 0分：无水肿
- 1分：轻微水肿（勉强可见）
- 2分：轻度水肿（明显隆起，边界清晰）
- 3分：中度水肿（隆起约1mm）
- 4分：重度水肿（隆起超过1mm，范围延伸）
- 红斑和焦痂形成：
- 每次观察需对每个测试部位的红斑和水肿分别评分并记录。
- 4.5 动物观察：
- 除了关注局部皮肤反应，在整个试验期间（包括敷贴间隔期），应密切观察动物的整体健康状况、行为、摄食、饮水、体重变化等，以评估受试样品可能产生的全身性影响。
5. 结果计算与解释
- 5.1 刺激评分计算：
- 对于每只动物，每个测试部位（受试样品、阴性对照、阳性对照），计算其在每次观察时间点（移除后立即观察和最终24小时观察）的红斑评分与水肿评分的总和（即每次观察一个总分）。
- 计算每只动物在所有观察时间点（通常包括D1移除后、D2移除后、D3移除后、D4移除后、D4移除后24小时，共5次）所得刺激总分的均值（即该动物对该样品的平均刺激指数）。
- 将所有受试动物的平均刺激指数再求算术平均值，得到该受试样品的最终平均刺激指数。
- 5.2 结果解释与分类：
- 将受试样品的最终平均刺激指数与阴性对照和阳性对照的结果进行比较。
- 根据普遍接受的评价标准（可参考ISO 10993-10或等效标准），通常将结果分为：
- 无刺激性 (Non-Irritating)： 平均刺激指数 ≤ 0.4（或根据具体标准要求）。
- 轻度刺激性 (Mildly Irritating)： 平均刺激指数 > 0.4 且 ≤ 2.0（或根据具体标准要求）。
- 中度刺激性 (Moderately Irritating)： 平均刺激指数 > 2.0 且 ≤ 5.0（或根据具体标准要求）。
- 重度刺激性 (Severely Irritating)： 平均刺激指数 > 5.0（或根据具体标准要求）。
- 此外，必须结合皮肤反应的性质（如是否出现严重红斑、水肿、出血、坏死、溃疡等不可逆损伤）、消退情况（最后一次观察24小时后反应是否明显消退）以及动物整体状况进行综合判断。
- 如果阴性对照出现明显反应，或阳性对照未达到预期反应，则试验结果可能无效。
6. 试验局限性
- 动物模型差异： 家兔皮肤与人皮肤在结构、厚度、屏障功能等方面存在差异，试验结果外推至人体需谨慎。
- 封闭效应： 半封闭式斑贴可能增强物质的渗透和刺激性，结果可能高于实际使用情况。
- 机械摩擦忽略： 试验主要测试化学刺激，未充分模拟实际使用中可能伴随的机械摩擦。
- 免疫反应： 本试验主要检测刺激性（非免疫反应），不能预测致敏性（过敏反应）。
- 动物福利： 动物试验涉及伦理问题。
7. 替代方法与展望
随着“3R原则”（减少Reduction、优化Refinement、替代Replacement）的发展，体外替代方法（如重建人体表皮模型试验 EpiDerm™, EpiSkin™, SkinEthic™ 等进行刺激测试）凭借其较好的预测性、可重复性和伦理优势，已成为评估化妆品原料和某些成品刺激性的重要手段，并在标准化方面取得了显著进展。对于法规允许的范畴（如化妆品），应优先采用经过验证的体外方法。然而，对于某些复杂配方或需要模拟多次暴露场景的安全性评估，一次使用多次刺激试验目前仍可能是必要的补充或验证手段。未来研究和标准化工作的方向是进一步提升体外模型对复杂产品和暴露场景的模拟能力与预测价值。
8. 结论
一次使用卫生用品多次皮肤刺激试验是针对特定使用场景（单次产品可能多次接触皮肤）设计的重要安全性评价方法。它通过模拟间歇性重复暴露，评估产品成分或其浸提液的潜在累积刺激效应。该试验要求严格按照标准化程序操作，包括动物选择与准备、样品处理、精确的敷贴与观察周期、规范的评分以及综合的结果分析。其结果对于判断卫生用品在预期使用条件下的皮肤刺激性风险具有重要参考价值。同时，应充分认识到该动物试验的局限性，并积极关注和应用不断发展的体外替代试验技术，在保障产品安全性的同时，推动动物福利的进步。所有动物实验的实施必须严格遵守所在地区的法律法规和伦理审查要求。