医疗器械的皮肤致敏试验（非浸提）

医疗器械皮肤致敏试验（非浸提）技术指南

医疗器械作为直接或间接接触人体组织、血液和体液的医疗产品，其生物安全性评价至关重要。皮肤致敏试验是评估医疗器械及其材料在反复或长期皮肤接触后引发过敏性接触性皮炎潜在风险的关键测试。对于不可吸收且预期直接接触完整皮肤的器械（如电极片、敷料、固定带、可穿戴设备部件等），非浸提（直接接触）试验是评估其致敏潜力的首选方法。

一、 基本原理与目的

皮肤致敏是一种由T淋巴细胞介导的迟发型超敏反应（Type IV）。非浸提试验模拟实际使用条件，直接将受试医疗器械或其代表性材料接触动物皮肤，通过诱导期（反复接触致敏原）和激发期（再次接触验证致敏性）观察是否产生红斑、水肿等过敏反应，从而预测其在人体使用中的致敏风险。核心目的是识别材料中潜在的致敏物质，并为生物相容性评估报告提供关键数据。

二、 适用标准与方法选择

• 核心标准：ISO 10993-10:2021《医疗器械生物学评价 - 第10部分：刺激与皮肤致敏试验》是国际公认的权威指南。
• 推荐方法：
  • 豚鼠最大化试验 (GPMT)： 敏感性高，适用于风险未知或复杂材料。
  • 豚鼠封闭贴敷试验 (Buehler Test)： 更接近实际使用（封闭接触），适用于已知风险较低或预期使用模式即为封闭贴敷的产品。
  • 小鼠局部淋巴结试验 (LLNA)： 使用小鼠，基于淋巴细胞增殖而非肉眼皮肤反应，可减少动物使用量，但需严格遵循验证程序，结果解释需结合其他数据。

三、 关键试验要素

1. 受试物准备：

   • 代表性样品： 使用与人体接触部分完全一致的材料（尺寸、形态、表面特性、灭菌状态）。
   • 形态处理： 固体材料需切割成合适尺寸（足够覆盖测试区域）；粉末需湿润后使用；液体或凝胶直接用原样。
   • 对照物： 阳性对照（常用己基肉桂醛、巯基苯并噻唑等已知强致敏剂）、阴性对照（生理盐水或溶剂对照）。阳性对照必须诱发明确反应，否则试验无效。

2. 动物模型：

   • 物种： 首选健康成年白化豚鼠（Hartley品系常用）。LLNA使用小鼠（CBA/Ca或CBA/J品系）。
   • 数量： 满足统计学要求，通常GPMT/Buehler每组≥10只试验组 + 5只对照组；LLNA每组≥4只。
   • 饲养： 符合动物福利标准，单笼或群养，自由饮水进食，适应性饲养≥5天。

3. 试验操作流程 (以GPMT/Buehler为例)：

   • 诱导期：
     • GPMT： 皮内注射弗氏完全佐剂（FCA）与受试物的乳化混合物（第0天），一周后（约第7天）在注射部位封闭贴敷受试物约48小时。
     • Buehler： 直接将受试物涂抹或贴敷于剃毛皮肤（肩胛骨间区域），用封闭性材料覆盖固定约6小时。每周重复1次，共3周（如第0、7、14天）。
   • 休息期： 诱导后约14天（避免激发干扰）。
   • 激发期： 在未诱导过的相邻部位（通常为对侧），以诱导期相同方式（GPMT仅贴敷，不含FCA）封闭贴敷受试物约24小时（GPMT）或6小时（Buehler）。
   • 观察与评分：
     • 移除激发贴片后约24小时（GPMT通常在移除后24h和48h评分；Buehler在移除后约24h评分）观察皮肤反应。
     • 采用标准化评分系统（如Magnusson & Kligman标准）评估红斑和水肿程度（0-4分）。

4. LLNA要点：

   • 受试物连续涂抹于小鼠双耳背侧3天。
   • 第5天注射放射性标记物（³H-胸苷或BrdU）。
   • 第6天取耳淋巴结，检测淋巴细胞增殖情况（通过同位素掺入量或BrdU标记细胞计数）。
   • 计算刺激指数（试验组/对照组增殖值之比）。指数≥3且有剂量反应关系通常认为有致敏性。

四、 结果分析与评价

1. 个体反应： 记录每只动物在激发部位的皮肤反应评分。
2. 发生率： 计算试验组和对照组出现阳性反应（通常评分≥1）的动物百分比。
3. 反应强度： 对比试验组与对照组的平均反应分值。
4. 统计学分析： 使用合适方法（如Fisher精确检验、卡方检验、t检验等）比较组间差异。
5. 致敏性判定：
   • 阳性： 试验组反应发生率显著高于对照组，且反应强度明显更强。LLNA刺激指数≥3且具有统计学意义。
   • 阴性： 试验组与对照组反应无显著差异，发生率低且反应弱。
   • 可疑/弱致敏性： 反应发生率或强度仅轻微升高，需结合材料化学信息、历史数据等综合判断。可能需补充测试（如重复试验、不同方法）。
6. 分级： 根据阳性反应发生率或刺激指数，可对致敏潜力进行分级（如极轻、轻度、中度、重度、极重度），为风险管理提供依据。

五、 试验报告要求

完整报告应清晰透明，包含：

• 试验目的与依据标准
• 受试物与对照物详细描述（来源、批号、形态、处理方式）
• 试验系统（动物品系、来源、数量、性别、体重）
• 试验方法详细步骤（诱导、激发时间方式、封闭材料、评分标准）
• 原始数据表格（每只动物每次评分）
• 反应发生率、平均分值列表
• 统计分析结果与方法
• 结果解释（致敏性判定及分级结论）
• 偏离方案的说明（如有）
• 实验室资质与GLP遵循声明（如适用）

六、 考量要点与局限性

• 动物模型外推： 动物结果预测人体风险存在不确定性（种属差异）。
• 封闭条件： GPMT/Buehler的强封闭状态可能高估某些材料在实际使用中的风险。
• 样品局限性： 测试样品可能无法完全代表最终产品的所有潜在化学浸出物（尽管测试材料本身）。
• 假阳性/假阴性： 试验操作（如过度刺激、封闭不良）或材料特性（如强刺激性掩盖致敏）可能导致错误结果。
• 综合评估： 皮肤致敏试验结果是医疗器械整体生物相容性评价的一部分，必须结合材料的化学表征（ISO 10993-18）、可沥滤物研究、已有的文献/数据库信息、临床经验等进行综合风险评估（ISO 10993-17）。

结论：

非浸提皮肤致敏试验是评估直接接触皮肤的医疗器械致敏风险的核心工具。严格遵循国际标准（ISO 10993-10），选择合适方法（GPMT, Buehler, LLNA），规范操作，并结合全面的化学信息和风险管理，方能科学有效地识别潜在致敏原，为医疗器械的安全上市和使用提供关键保障。

附录：常用参考表格示意

表1：皮肤反应评分标准 (Magnusson & Kligman)

| 肉眼观察结果 | 评分 | | ：------------------------- | :--- | | 无可见变化 | 0 | | 离散或轻度红斑 | 1 | | 中度红斑（边界清晰） | 2 | | 重度红斑（鲜红，伴轻微水肿） | 3 | | 重度红斑（紫红，伴中度水肿，可能有水疱/糜烂） | 4 |

表2：样品形态与试验应用示例参考