药品细菌内毒素试验 - 中析研究所生物检测中心

药品细菌内毒素试验：原理、方法与质量控制

药品安全性关乎生命健康，其中细菌内毒素（主要成分为革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖）是引发患者发热、休克甚至死亡的关键风险物质。因此，细菌内毒素试验（Bacterial Endotoxins Test, BET）成为各国药典强制要求的无菌药品（特别是注射液、植入剂等）及医疗器械的关键质控环节，旨在确保产品内毒素含量严格低于安全限值（内毒素限值）。

一、核心原理：鲎试剂反应机制

试验基石是鲎试剂（Limulus Amebocyte Lysate, LAL）。其来源于鲎（一种海洋节肢动物）血液中的阿米巴样细胞裂解物，内含敏感的凝固酶原系统：

触发级联反应：内毒素通过激活凝固酶原酶原，启动一系列酶促反应。
凝胶形成核心：反应最终激活凝固蛋白原，转化为不溶性的凝固蛋白凝胶。
检测依据：
- 凝胶法：肉眼或仪器直接观察凝胶形成（定性或半定量）。
- 光度测定法
  - 浊度法：反应过程浊度变化速率与内毒素浓度成正比。
  - 显色法：人工合成显色底物（如Boc-Leu-Gly-Arg-pNA）释放黄色对硝基苯胺（pNA），405nm测吸光度变化速率。

二、核心试验方法详解

凝胶限度试验
- 目的：判定供试品内毒素含量是否低于规定限值。
- 操作：将系列稀释的内毒素标准品及供试品溶液分别与鲎试剂混合。
- 孵育：37°C ± 1°C水浴一定时间（通常60±2分钟）。
- 判定：
  - 阳性对照：必须形成坚实凝胶（验证试剂灵敏度）。
  - 阴性对照：必须无凝胶形成（排除试剂自凝或污染）。
  - 供试品管：若形成坚实凝胶（翻转180°不流动），判为不符合规定（内毒素≥限值）；无凝胶形成，判符合规定。需验证无干扰。
光度测定法（定量）
- 目的：精确测定供试品内毒素含量（EU/ml或EU/mg）。
- 分类：
  - 动态浊度法/显色法：连续监测反应速率（反应时间 vs 浊度/吸光度），速率与内毒素浓度对数呈线性关系。需标准曲线。
  - 终点浊度法/显色法：反应终点测定浊度/吸光度，与内毒素浓度呈线性关系。需标准曲线。
- 关键步骤：
  - 建立标准曲线（符合规定）。
  - 验证供试品无干扰（回收率50%-200%）。
  - 供试品溶液检测（平行多管），计算含量。

三、试验有效性与结果判定的核心支柱

试验结果有效必须满足以下对照要求：

阴性对照：无凝固（光度法：反应度<标准曲线最低点）。
阳性对照：凝固（光度法：反应度在标准曲线范围内）。
供试品阳性对照（PPC）：在供试品溶液中加入标准内毒素至2λ浓度，测得回收率应在50%-200%之间（证明样品无抑制/增强干扰）。
标准曲线（光度法）：相关系数|r| ≥ 0.980。

四、试验成功的关键因素与要点

严格无菌操作与环境：所有器材（玻璃器皿、枪头、试管）必须经除内毒素处理（250°C干烤≥30分钟或验证有效方法）。操作在洁净环境中（如超净台）进行，防止外源性内毒素污染。
试剂与水的质量：使用符合要求的内毒素检查用水（BET水），内毒素含量<0.015 EU/mL。鲎试剂需明确标示灵敏度（λ），并在有效期内使用。
样品前处理与干扰排除：
- 溶解/稀释：使用BET水或合适溶剂，目标内毒素浓度在标准曲线最佳范围内（通常在0.5λ-2λ附近）。
- pH调节：确保供试品溶液pH在6.0-8.0范围（鲎试剂最适pH）。常用酸碱或缓冲液（验证无干扰）。
- 干扰排除方法：稀释法（最常用）、过滤法、中和法、透析法等。必须通过PPC试验验证有效性。
温度与时间控制：孵育温度严格控制在37±1°C，时间精确控制（特别是光度法）。
标准品管理：使用国家认可的内毒素工作标准品（RSE）或经标定的内毒素对照品（CSE）。按说明书复溶、分装、储存（-20°C以下）。

五、方法适用性确认（验证）

在首次对某品种进行BET或试验条件变更时，需进行方法适用性试验：

确定限值（L）：通常按公式 L = K / M 计算（K：人体可接受最大内毒素阈值，5 EU/kg/hr；M：最大临床剂量/kg/hr）。
确定最大有效稀释倍数（MVD）：MVD = L / λ （λ为试剂灵敏度）。
干扰试验：
- 制备含标准内毒素（如标示灵敏度λ的2λ, 1λ, 0.5λ, 0.25λ）的供试品溶液。
- 用BET水制备相同浓度系列的标准溶液。
- 分别测定内毒素含量（光度法）或找到反应终点浓度（凝胶法）。
- 计算供试品溶液回收率 = (测得值 / 加入值) × 100%。
- 合格标准：回收率在50% - 200%之间（通常是3份平行样品的均值）。

六、应用实例与价值

注射用水（WFI）：确保生产过程关键物料的内毒素水平符合药典要求（通常<0.25 EU/ml）。
大输液（如葡萄糖注射液、氯化钠注射液）：监控终产品，防止因生产过程污染或包装密封不良导致热原反应。
生物制品（如疫苗、单抗）：严格监控生产各阶段（尤其细胞培养、纯化步骤）及终产品内毒素。
植入性医疗器械：通过浸提法检测可浸提出的内毒素总量是否低于限值。

七、技术发展与展望

重组C因子法（rFC）：利用基因工程表达的重组C因子替代传统鲎试剂，避免依赖野生鲎资源，特异性更佳（只响应内毒素），减少β-葡聚糖干扰。已被多国药典收录（如EP, USP, ChP）。
自动化与高通量：自动化液体处理工作站与检测设备的应用，提高效率、减少人为误差。
方法学完善：持续研究更灵敏、抗干扰能力强、适用于复杂基质（如高粘度、高蛋白、含有机溶剂）的新方法。

结论

细菌内毒素试验是保障药品和医疗器械临床安全性的重要屏障。深入理解其原理、严格遵守标准化操作规程（包括样品处理、干扰排除、对照设置）并严格进行方法验证，是获得可靠结果、确保受试品符合安全性要求的关键。随着重组技术及自动化发展，该领域正朝着更可持续、更精准的方向迈进。实验人员应始终依据最新版国家药典（如《中国药典》）或国际规范进行操作和判定。

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