药品溶血与凝聚检查法

1. 目的 本方法旨在评估注射剂及可能接触循环系统的药品引发红细胞破裂（溶血）或聚集（凝聚）的能力，确保其临床用药的安全性。

2. 适用范围 适用于：

静脉注射剂
肌肉注射剂
皮下注射剂
滴眼剂（评估眼部血管刺激性风险）
其他可能接触血液或含血管组织的制剂

3. 原理 将规定浓度的供试品溶液与哺乳动物（通常为家兔）的新鲜抗凝血液或洗涤红细胞悬液混合，在特定条件下（通常为37℃）温育一定时间。通过肉眼观察或仪器测定（如分光光度法）上清液中游离血红蛋白含量或红细胞凝聚状态，判断供试品是否具有溶血或凝聚活性。

4. 仪器与材料

恒温水浴箱：控温精度±0.5℃，设定37℃。
离心机：可达到2500 rpm（约1500×g）。
分光光度计（若进行肉眼观察为主要判定时，非必需）。
显微镜（凝聚检查必备）。
具塞试管或比色管：规格一致（如10mL或15mL）。
刻度吸管、移液器：满足精度要求（如0.1mL、0.2mL、1.0mL、2.0mL、5.0mL）。
血细胞计数板（用于必要时调整红细胞浓度）。
家兔：健康无孕，体重2.5kg以上，耳缘静脉采血。
抗凝剂：3.8%枸橼酸钠溶液（生理盐水配制），或肝素钠。
生理盐水（阴性对照）：0.9%氯化钠注射液。
蒸馏水（阳性对照-溶血）。
阳性对照-凝聚：可选适宜浓度的特定凝聚剂（如聚凝胺溶液），依品种要求设定。
稀释液/悬浮液：生理盐水或适宜的缓冲液（如pH 7.4磷酸盐缓冲液）。

5. 供试品溶液制备

按药品质量标准或研究方案规定配制。通常使用生理盐水或适宜缓冲液稀释至规定浓度（如临床使用浓度或更高浓度）。
溶液pH值应调整至6.0-8.0（必要时），渗透压应尽可能接近生理范围（约300 mOsmol/kg）。
溶液应澄清，必要时可离心或过滤（需评估滤膜影响）。

6. 红细胞悬液制备

采血与抗凝：无菌操作采集家兔静脉血，立即加入含抗凝剂的容器中（血：抗凝剂体积比通常为4：1，依据抗凝剂说明调整），轻柔混匀。
洗涤红细胞：
1. 取适量抗凝血，加入3-5倍体积生理盐水，轻柔混匀。
2. 离心（1500-2000 rpm，约800-1000×g，5分钟）。
3. 小心吸弃上清液及白细胞、血小板层（白膜层）。
4. 重复洗涤步骤（2）和（3）至少3次，直至上清液无色澄清。
配制2%红细胞悬液：取压积红细胞，用生理盐水或适宜缓冲液稀释，使红细胞浓度约为2%（v/v）。可用生理盐水稀释少量压积红细胞后，用血细胞计数板校准浓度。

7. 试验步骤

分组与加样：取洁净具塞试管若干，按下表加入各溶液：
加入红细胞悬液：向上述各试管中分别加入2%红细胞悬液2.5 mL，立即轻轻摇匀（避免剧烈振荡产生泡沫）。
温育：
- 将试管置37±0.5℃恒温水浴中温育。
- 温育时间通常为3小时（具体时间可根据品种要求调整，如1、2、3、4小时）。
- 温育期间每隔30分钟轻轻取出试管观察一次（避免振荡），记录有无溶血（溶液变红）、凝聚（颗粒或絮状物）现象。
温育后观察与判定：
- 溶血初步观察：温育结束后，立即将各管轻轻倒置1-2次，肉眼观察上清液颜色。
- 凝聚初步观察：观察管底沉淀状态及有无不易摇散的颗粒或絮状物。
- 离心：将试管以1500-2000 rpm（约800-1000×g）离心5分钟。
- 溶血最终判定 (肉眼法)：
  - 观察上清液：若完全澄明，无色或微黄色（与阴性对照管相似），判为无溶血。
  - 若上清液呈红色或棕红色（与阳性对照管相似），判为溶血阳性。
  - 介于两者之间（如浅红色、橙红色）或有少量红细胞残留，需进一步进行血红蛋白定量判定。
- 凝聚最终判定：
  - 轻轻倾斜或轻摇试管，观察管底沉淀物。
  - 若沉淀物不成团块，轻摇后红细胞能均匀分散成混悬液（与阴性对照管相似），判为无凝聚。
  - 若沉淀物成团块，或轻摇后红细胞不能均匀分散，出现可见的颗粒、絮状物或团块（与阳性凝聚对照管相似），判为凝聚阳性。
  - 显微镜确认（关键步骤）：取管底沉淀物或管内容物1滴置载玻片上，盖上盖玻片，显微镜（高倍镜，如400×）下观察。
    - 若无凝聚：红细胞均匀分散，形态正常。
    - 若凝聚：可见多个红细胞粘附聚集在一起形成大小不等的团块。
- 溶血判定 (分光光度法 - 可选/定量)：
  1. 取离心后上清液适量。
  2. 用生理盐水或上清液对应的空白管溶液（如仅含供试品稀释液）作参比。
  3. 在波长540-545 nm处测定吸光度(A₅₄₀)。
  4. 同时测定阳性对照管（蒸馏水）和阴性对照管（生理盐水）吸光度（Aₚₒₛ, Aₙₑ₉）。
  5. 计算溶血率（%）：溶血率 (%) = [(Aₛₐₘ - Aₙₑ₉) / (Aₚₒₛ - Aₙₑ₉)] × 100%
  6. 判定：通常溶血率 > 5% 认为有溶血活性。具体标准依据品种要求或指导原则设定（如某些情况下设定为<2%~5%为可接受）。

8. 结果判定

溶血：
- 供试品管溶液在温育期间或温育后呈红色澄清，特别是离心后上清液红色澄明（肉眼法），或溶血率 > 规定限度（分光光度法），判为溶血不合格。
- 供试品管溶血现象不明显于阴性对照管，或溶血率 ≤ 规定限度，判为符合要求。
凝聚：
- 供试品管在温育期间出现肉眼可见凝聚颗粒/絮状物，或离心后沉淀物成团块不易摇散（肉眼），或显微镜下观察到红细胞明显聚集形成团块，判为凝聚不合格。
- 供试品管凝聚现象不明显于阴性对照管，显微镜下观察红细胞呈均匀分散状态，判为符合要求。
系统适用性：
- 阴性对照管（生理盐水）应无溶血和凝聚。
- 溶血阳性对照管（蒸馏水）应呈完全溶血（上清液深红澄明，离心后无红细胞沉淀）。
- 凝聚阳性对照管（如适用）应出现明显凝聚现象（肉眼及镜下）。若对照结果不符合要求，试验无效，应查找原因后重试。

9. 注意事项

动物福利与伦理：动物实验应遵循“3R”原则（减少、优化、替代），严格遵守动物伦理规定，操作过程应人道，减少动物痛苦。
无菌与清洁：试验器具（试管、吸管等）应清洁、干燥、灭菌或无菌处理，避免微生物污染干扰结果。
血液新鲜度：血液采集后应尽快使用（通常在4小时内完成试验），洗涤好的红细胞悬液也应尽快使用。避免冷藏或冷冻红细胞（除非方法学验证支持）。
轻柔操作：所有涉及红细胞的步骤（混匀、转移、离心）均需轻柔，避免人为机械损伤导致假阳性溶血。
温度控制：恒温水浴温度必须严格控制（37±0.5℃），温度过高或波动大会影响结果。
pH与渗透压：供试品溶液pH和渗透压应尽可能模拟生理条件或进行调节，避免因pH或渗透压异常导致的假阳性/假阴性。
阳性凝聚剂：选择合适的阳性凝聚对照至关重要，应能稳定诱导肉眼及镜下可见的明确凝聚。
显微镜确认：凝聚判定必须经过显微镜确认，肉眼观察有时不可靠（可能与药物颗粒、气泡等混淆）。
结果记录：详细记录试验过程、观察现象（包括温育期间）、离心前后状态、显微镜下形态描述、溶血率计算（如适用）及判定结论。必要时拍照留存。
方法学适用性：对于特殊剂型（如乳剂、脂质体、含油溶液）、有色溶液或本身有干扰的供试品，需进行方法学验证或采用替代方法（如体外红细胞膜稳定性试验等）。

10. 报告 报告应清晰包含以下信息：

供试品名称、批号、规格。
供试品溶液配制方法（浓度、溶剂、pH/渗透压调节情况）。
红细胞来源（动物种类）、抗凝剂种类、红细胞悬液浓度。
试验条件（温育温度、时间、离心条件）。
所用对照品及结果（阴性、溶血阳性、凝聚阳性）。
供试品管各时间点的观察现象描述（温育期间、温育后、离心后）。
显微镜观察结果描述及照片（如拍摄）。
溶血率计算值（如采用分光光度法）。
最终判定结论（是否符合规定）。
试验日期、试验人员签名。

本方法遵循药品安全性评价的基本原则，是保障注射剂等药品临床使用安全的关键质控项目之一。具体品种的标准操作细节（如浓度、判定限度）应依据其质量标准或研究方案执行。