致泻大肠埃希氏菌检测 - 中析研究所生物检测中心

致泻大肠埃希氏菌检测：原理、方法与防控

一、病原体概述

大肠埃希氏菌（Escherichia coli）是人和温血动物肠道中的常见共生菌。然而，特定携带毒力基因的菌株可导致人类腹泻性疾病，统称为致泻大肠埃希氏菌（Diarrheagenic Escherichia coli, DEC）。主要致病类型包括：

肠产毒性大肠埃希氏菌（ETEC）： 产生肠毒素（耐热肠毒素ST和/或不耐热肠毒素LT），是旅行者腹泻和儿童腹泻的重要病原。
肠致病性大肠埃希氏菌（EPEC）： 主要在婴幼儿中引起水样便腹泻，通过“粘附抹平”损伤肠上皮。
肠侵袭性大肠埃希氏菌（EIEC）： 生物学特性、致病机制与志贺菌类似，可侵入并破坏肠上皮细胞，引起痢疾样症状。
肠出血性大肠埃希氏菌/产志贺毒素大肠埃希氏菌（EHEC/STEC）： 产生强效的志贺毒素（Stx1, Stx2），可引起出血性肠炎，严重并发症包括溶血性尿毒综合征（HUS）。O157:H7是最著名血清型，但非O157 STEC（如O26, O103, O111, O121, O145等）日益重要。
肠集聚性大肠埃希氏菌（EAEC）： 以特征性“堆集”方式粘附于肠上皮，产生毒素和生物膜，可引起儿童及旅行者持续性腹泻。
弥散粘附性大肠埃希氏菌（DAEC）： 粘附模式呈弥散状，致病性尚有争议，主要与儿童腹泻相关。

二、检测的必要性

公共卫生监测： 监测食源性疾病暴发、追踪传染源、识别流行菌株。
食品安全控制： 确保食品（尤其是肉类、乳制品、果蔬、水）免受污染，评估加工过程卫生状况。STEC（特别是O157:H7及特定非O157）是食品安全领域的重点监控对象。
临床诊断： 准确诊断感染类型，指导治疗（如避免对EHEC/STEC感染者使用抗生素，可能增加HUS风险）和感染控制。
水源安全： 监测饮用水和娱乐用水质量，预防水源性传播。

三、主要检测方法

检测通常包括**富集培养、分离筛选、确证鉴定（生化、血清学、毒素检测）和分子分型（溯源）**几个环节。

1. 传统培养与生化鉴定
- 富集培养： 使用选择性增菌液（如改良胰蛋白胨肉汤，mTSB; 新生霉素改良大肠杆菌肉汤，NBEC）增加目标菌数量。
- 分离筛选：
  - 显色培养基： 利用特定酶底物产生颜色差异区分大肠杆菌（常显蓝色/绿色）及疑似致泻菌株。
  - 选择性培养基： 如麦康凯琼脂（MAC）、山梨醇麦康凯琼脂（SMAC - 用于O157:H7筛选，该菌株通常不发酵山梨醇呈现无色菌落）、彩虹®O157琼脂等。
- 生化鉴定： 对可疑菌落进行IMViC（吲哚、甲基红、VP、枸橼酸盐利用）等试验，确认为大肠埃希氏菌。
- 血清学分型： 使用特异性抗血清进行O（菌体）和H（鞭毛）抗原分型，是鉴定特定血清型（如O157:H7）的传统金标准方法，但对非O157 STEC分型覆盖有限且耗时。
2. 毒素及毒力因子检测
- 免疫学方法：
  - 乳胶凝集试验： 快速检测菌落或富集液中的特定O抗原（如O157）或志贺毒素（Stx）。
  - 酶联免疫吸附试验（ELISA）： 检测培养物上清液或富集液中的LT、ST、Stx等毒素或特定粘附因子。有商品化试剂盒可用。
- 细胞毒性试验（Vero细胞/Ehlich细胞）： 将菌株培养滤液作用于敏感细胞系，观察细胞病变效应（CPE），是检测Stx生物活性的经典方法，但操作复杂、耗时，多用于研究或参比实验室。
3. 分子生物学检测
- 聚合酶链式反应（PCR）及多重PCR： 当前最核心、最常用的检测和分型手段。
  - 原理： 特异性扩增致泻大肠杆菌各类型的特征性毒力基因：
    - ETEC: elt (LT), est (ST)
    - EPEC: eae (紧密素), bfpA (束状菌毛 - 典型EPEC), 区分典型(atypical) EPEC
    - EIEC: ipaH (侵袭性质粒抗原H)
    - EHEC/STEC: stx1, stx2 (志贺毒素基因), eae (紧密素 - 常与严重疾病相关), 有时加测 ehxA (溶血素)
    - EAEC: aggR (聚集调节基因), aatA (毒力质粒片段)等
    - DAEC: daaD (F1845菌毛基因)等
  - 优点： 灵敏度高、特异性强、速度快（数小时）、可同时检测多种毒力基因/类型（多重PCR）、能直接检测部分经过富增的样本（缩短周期）。
  - 应用： 用于可疑菌落的毒力基因鉴定、食品/环境样本的快速筛查（常与富增结合）、临床样本（粪便）的直接检测（需验证方法性能）。实时荧光定量PCR（qPCR）还可进行定量或半定量分析。
- 基因分型技术（溯源）：
  - 脉冲场凝胶电泳（PFGE）： 传统分子分型金标准，用于暴发溯源和菌株关联性分析。分辨力高，但操作复杂、标准化要求高、耗时。
  - 多位点序列分型（MLST）： 基于数个看家基因序列的分型方法，利于全球数据库比对和长期进化研究。
  - 核心基因组多位点序列分型（cgMLST）/ 全基因组测序（WGS）： 日益成为最高分辨率的溯源和分子分型手段。 基于全基因组或核心基因组大量位点（>1000个）的SNP差异或等位基因谱进行高精度分型，不仅能精确溯源，还能深入解析毒力基因谱、耐药基因谱等，是未来发展方向。需要生物信息学分析支持。
4. 其他方法
- 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）： 快速鉴定分离菌株到种水平（大肠埃希氏菌）。
- 基于CRISPR等的新兴技术： 正在开发中，潜力在于更高的特异性和便捷性。

四、方法选择与流程（以食品中STEC检测为例）

富集： 样本（如碎牛肉）在选择性增菌液（如mTSB+新生霉素）中培养。
筛查：
- 免疫磁珠分离（IMS）： 使用包被有特异性抗体（如抗O157）的磁珠捕获目标菌，提高选择性（尤其对O157效果显著）。富增液上清也可直接用于PCR或ELISA筛查。
- 分子筛查： 提取富增液DNA，进行多重PCR检测 stx1, stx2 及关键血清群标记基因（如 wzx O157, wbdA O26, ihp1 O103, IS- O111, wbdB O121, wzx O145，有时加测 eae）。
分离培养：
- 若筛查阳性（如PCR检出 stx +/- eae +/- 特定O基因）：将富增液（或IMS捕获物）划线接种至选择性/显色培养基（如SMAC，针对不同O型的特异显色平板）。
- 挑取特征性可疑菌落（如SMAC上不发酵山梨醇的无色菌落可能为O157）。
确证与鉴定：
- 生化鉴定确认为大肠埃希氏菌。
- 血清学分型（特别是对O157:H7）或分子检测（PCR）确认O:H血清型。
- 分子检测（PCR）确证毒力基因 (stx1/2, eae等)。
- 必要时进行毒素检测（ELISA或细胞试验）。
分型与溯源（暴发调查）： 对阳性分离株进行PFGE或（更优）WGS分析，比对数据库确定关联性。

五、结果解读与报告

阳性结果： 报告检出特定类型的致泻大肠埃希氏菌（如：检出产志贺毒素大肠埃希氏菌O157:H7，携带 stx2 和 eae 基因）。需结合检测方法说明（如：分子检测阳性提示存在目标基因，但不一定代表存在活的完整病原体）。
阴性结果： 在所采用的检测方法灵敏度下，未检出目标致泻大肠埃希氏菌。
定量与限量： 多数食品安全标准基于“不得检出”（n=5, c=0/m=未检出）原则，特别是在即食食品和高风险食品（如预包装即食沙拉）中。具体限量标准需遵循国家或地区的法规要求（如：部分法规要求25g样品中不得检出O157:H7或特定非O157 STEC）。

六、预防与控制

食品安全： 严格执行良好农业规范（GAP）、良好操作规范（GMP）、危害分析与关键控制点（HACCP）体系。加强原料（特别是牛肉、生乳）、水源管控。彻底加热食物（中心温度≥70℃）。生熟分开，防止交叉污染。严格控制食品加工环境卫生，防止生物膜形成。
个人卫生： 饭前便后、接触动物后务必用肥皂和流动水彻底洗手。
水源管理： 保障饮用水安全，规范废水处理。避免在娱乐用水中发生粪口途径传播。
疫情应对： 快速准确的实验室检测是识别和应对食源性疾病暴发的关键。及时隔离患者，追踪传染源和密切接触者。

七、挑战与展望

非O157 STEC的挑战： 血清型众多，毒力差异大，缺乏像O157:H7那样高效的选择性培养基，检测更依赖分子方法。
方法的灵敏度和特异性平衡： 需要持续优化方法，减少假阴性和假阳性。
快速与精准的平衡： 快速筛查方法（如直接样本PCR）虽快，但需配套高效的分离培养确证流程以获取活菌用于溯源和耐药性研究。
全基因组测序（WGS）的应用： WGS在提供高分辨率分型溯源的同时，能全面解析菌株的毒力、耐药和进化特征，是未来监测和研究的核心工具，但成本、数据分析能力和标准化仍需推进。

结论：

致泻大肠埃希氏菌是重要的食源性和水源性病原体。其检测技术已从传统的培养生化方法发展为以分子生物学为核心（尤其是多重PCR检测毒力基因）的综合体系，结合免疫学方法和日益普及的WGS分型。选择合适的检测方法组合对于公共卫生监测、食品安全保障、临床诊断和疫情控制至关重要。持续改进检测技术的速度、准确性、通量和成本效益，并加强其在源头预防和控制措施中的应用，是降低致泻大肠埃希氏菌感染风险的关键。