需氧嗜温菌芽孢检测 - 中析研究所生物检测中心

需氧嗜温菌芽孢检测技术指南

一、引言

需氧嗜温菌芽孢（Aerobic Mesophilic Spores）是一类能够在有氧条件下生长、最适生长温度通常在25-45℃之间（多数接近37℃），并能形成具有极强抗逆性芽孢的细菌总称。这些芽孢对热（如巴氏灭菌）、干燥、辐射及多种化学消毒剂具有显著的抵抗力，是评价食品、药品、化妆品安全性和灭菌工艺有效性的关键生物指示物。在罐头食品、乳制品、注射剂等生产领域，其残留水平直接关系到产品的商业无菌状态及货架期安全。因此，建立准确可靠的需氧嗜温菌芽孢检测方法至关重要。

二、检测原理与依据

检测的核心原理基于芽孢独特的生物学特性：

耐热性区分： 通过高温处理（通常80℃水浴10分钟）杀死样品中所有不耐热的营养细胞（vegetative cells）和部分抵抗力较弱的不产芽孢细菌。
芽孢活化与萌发： 幸存的芽孢在适宜的液体培养基或固体平板培养基上，于需氧及适温（通常30-35℃）条件下，吸收水分、营养物质，启动萌发程序，最终发育成具有代谢活性的营养细胞。
增殖与检测： 新形成的营养细胞迅速分裂增殖，形成肉眼可见的菌落（CFU，菌落形成单位），通过对菌落数量的统计，即可推算出原始样品中具有活性的需氧嗜温菌芽孢数量。

检测标准通常遵循国内外通用规范，如ISO 7937:2004（水平法计数产气荚膜梭菌）、GB 4789.26（食品商业无菌检验）中相关芽孢检测部分，以及各行业特定的无菌保障指南。

三、检测所需材料与设备

样品： 无菌采集的代表性待检样品（液体、固体或膏体）。
培养基：
- 胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）： 通用性好，营养丰富，适用于绝大多数需氧嗜温菌芽孢的复苏与生长。
- 胰酪大豆胨肉汤培养基（TSB）： 用于样品稀释、混匀及可能的增菌步骤（非必需）。
- (注：培养基需按标准配制、灭菌（121℃, 15分钟）并验证无菌生长及促生长能力)
稀释液： 磷酸盐缓冲液（如0.1%蛋白胨水缓冲液或生理盐水），需灭菌。
主要设备：
- 恒温水浴锅（精度±0.5℃，用于80℃热处理）
- 恒温培养箱（设定30-35℃）
- 均质器/拍打式均质袋（处理固体样品）
- 无菌吸管（1mL、10mL）、无菌锥形瓶/稀释瓶、无菌培养皿（9cm直径）
- 无菌涂布棒（倾注法无需）
- 菌落计数器
- 高压蒸汽灭菌锅
- 生物安全柜或超净工作台（确保无菌操作）
- 冰箱（2-8℃保存培养基等）
其他： 75%乙醇消毒剂、记号笔、实验室记录本、计时器等。

四、标准检测步骤详解

样品前处理：
- 液体样品： 轻轻摇匀，无菌操作吸取适量（如10mL）样品加入适量无菌稀释液（如90mL），制成10⁻¹的初始稀释液。剧烈振摇混合至少15秒。
- 固体/半固体样品： 无菌称取代表性部分（如25g）放入无菌均质袋中，加入适量无菌稀释液（如225mL），在均质器中充分均质1-2分钟，制成10⁻¹的初始稀释液。
- 后续稀释： 根据预期芽孢含量，按10倍递增法（如吸取10mL 10⁻¹稀释液加入90mL稀释液制成10⁻²，依次类推）制备所需梯度稀释液（通常至少做2-3个连续稀释度）。
热处理（杀灭营养细胞）：
- 无菌操作，吸取各梯度稀释液（通常选择预计CFU在30-300之间的1-2个合适稀释度）各1mL，分别加入无菌试管中。
- 将所有含样品的试管（包括空白对照稀释液管）完全浸没于80±0.5℃恒温水浴锅中。
- 准确计时10分钟。确保所有样品液面都在水面以下，温度恒定。
- 立即取出试管，迅速放入冰水浴中冷却至室温（约5-10分钟），以终止热效应。
接种与培养：
- 倾注法（推荐）：
  - 无菌操作，吸取经热处理并冷却后的样品液（通常取1mL）加入无菌培养皿中。
  - 将融化并冷却至45-50℃的TSA培养基倾注约15-20mL入培养皿内。
  - 立即在台面上水平旋转培养皿数次，使样品与培养基充分混匀。
  - 待琼脂凝固。
- 涂布法（可选）：
  - 无菌操作，将融化并冷却至约45-50℃的TSA培养基约15-20mL倾注入无菌培养皿中，静置凝固成平板。
  - 无菌吸取经热处理并冷却后的样品液（通常取0.1mL或0.2mL）滴加在凝固的平板表面中央。
  - 用无菌涂布棒将液滴在琼脂表面均匀涂抹开。
- 平行与空白：
  - 每个待测稀释度至少做两个平行平板。
  - 设置空白对照：取1mL无菌稀释液经同样热处理、冷却后，按上述方法倾注或涂布于TSA平板。用于验证无菌操作及培养基的无菌性。
- 培养： 将所有平板（样品及空白）倒置放入30-35℃恒温培养箱中，培养48-72小时。
菌落计数与报告：
- 培养结束后取出平板，肉眼观察或在菌落计数器辅助下计数。
- 选择菌落数在30-300 CFU之间的平板进行计数（涂布法需考虑接种量体积）。若所有平板均小于30 CFU，记录实际最小稀释度的菌落数；若大于300 CFU，记录为“多不可计”(TNTC)。
- 空白对照平板应无菌落生长。若有菌落生长，本次实验无效，需重做。
- 计算结果：
  - 倾注法（接种1mL）： 芽孢数(CFU/g 或 CFU/mL) = 平均菌落数 × 稀释倍数 × (1/样品重量或体积) (例：若10⁻³稀释度平均菌落数80，则芽孢数 = 80 × 10³ × 1 = 80, 000 CFU/g或mL)
  - 涂布法（接种0.1mL）： 芽孢数(CFU/g 或 CFU/mL) = 平均菌落数 × 稀释倍数 × 10 × (1/样品重量或体积) (例：若10⁻²稀释度平均菌落数45，则芽孢数 = 45 × 10² × 10 × 1 = 45, 000 CFU/g或mL)
- 报告：
  - 报告每克(固体)或每毫升(液体)原始样品中的需氧嗜温菌芽孢数量，单位为CFU/g 或 CFU/mL。
  - 若所有稀释度平板均无菌落生长，报告为“未检出需氧嗜温菌芽孢 (< 1 × 最低稀释倍数 CFU/g或mL)”。
  - 若结果为TNTC，应报告为“> 300 × 最高稀释倍数 CFU/g或mL”。
  - 注明检测方法（如倾注法）、培养温度和时间。

五、质量控制要点

培养基质量控制： 每批新配制或购买的培养基需进行无菌检查（30-35℃培养48h无菌落生长）和促生长能力验证（使用标准菌株如枯草芽孢杆菌ATCC 6633，应生长良好）。
无菌操作： 所有步骤必须在生物安全柜或超净工作台内进行，严格遵守无菌操作规范，防止外来污染。
温度准确性：
- 水浴锅温度必须精确控制在80±0.5℃，并定期用校准温度计验证。
- 恒温培养箱温度需在30-35℃范围内稳定均匀，定期校准。
时间控制： 80℃热处理必须精确控制在10分钟。
稀释均匀性： 每次稀释转移后必须充分振摇或涡旋混匀。
样品代表性： 确保采集的样品具有代表性，处理过程避免交叉污染。
阳性对照（可选但推荐）： 定期使用已知数量的枯草芽孢杆菌芽孢悬液作为阳性对照，验证整个检测流程的有效性。
阴性（空白）对照： 必须包含空白稀释液和平板空白对照，确保无菌生长。

六、结果解释与应用

低芽孢数： 通常指示生产工艺控制良好，灭菌/抑菌措施有效，产品在预期贮存条件下发生微生物腐败变质的风险较低。
高芽孢数： 警示可能存在原料污染、生产环境控制不当（如设备清洁消毒不彻底、空气洁净度不足）或关键杀菌工艺（如热力灭菌）参数设定不合理/执行不到位等问题。需立即追溯污染源并采取纠偏措施。
无菌保障： 在要求“商业无菌”的食品（如低酸性罐头）和无菌药品中，需氧嗜温菌芽孢检测是验证最终产品是否达到灭菌要求（通常应未检出）的重要依据之一。
工艺验证： 用于评估和验证清洁消毒程序、灭菌工艺（如热力、辐照）的有效性。

七、注意事项

安全第一： 80℃水浴操作时佩戴耐热手套，防止烫伤。处理未知样品时遵守实验室生物安全规定。
及时冷却： 热处理后务必立即充分冷却样品，防止残留热效应对芽孢造成额外损伤导致计数偏低。
培养时间： 严格遵循培养时间要求。某些芽孢萌发较慢，过早观察可能导致低估。
芽孢分布： 芽孢在样品中分布可能不均匀，确保样品充分混匀代表性至关重要。
干扰物质： 某些产品（如高油、高糖、高盐、含抑菌剂）可能干扰芽孢复苏或生长，必要时需进行样品特殊处理（如中和、过滤冲洗）或选择更适宜的复苏培养基。方法需验证。
方法局限性： 该方法检测的是能够在所用培养基上、在设定条件下复苏生长的活性需氧嗜温菌芽孢。无法检出处于极度休眠状态或存在损伤但未死亡的芽孢，也不能区分具体菌种。若需鉴定菌种，需对典型菌落进行进一步纯化与生化/分子生物学鉴定。

八、结语

需氧嗜温菌芽孢检测是一项基础而关键的微生物学检验技术，对保障食品、药品、化妆品等产品的安全、质量和延长货架期具有不可替代的作用。严格执行标准化的操作流程、严密的质控措施和对结果的准确解读，是获得可靠数据并有效服务于无菌保障体系的根本。持续的实验室能力验证和方法优化，是提升检测结果准确性与可比性的重要途径。掌握此技术要点，对于相关领域微生物风险的控制至关重要。

附录：图示关键步骤（建议手绘示意图风格）

样品稀释示意图： 展示固体样品均质、液体样品稀释及10倍梯度稀释过程。
热处理示意： 试管浸入80℃水浴锅，标注温度与时间。
倾注法操作示意： 展示吸取样品、倾注融化的TSA培养基、旋转混匀。
涂布法操作示意： 展示在预制平板上滴加样品、使用涂布棒均匀涂抹。
培养平板示意： 倒置平板在恒温培养箱中培养。
菌落计数示意： 展示30-300 CFU范围内计数合格的平板。
芽孢结构简图： 简明标注核心（DNA）、皮层（Peptidoglycan）、芽孢衣（Protein Coat）、外膜等关键结构，说明其抗性来源。