厌氧亚硫酸盐还原菌检测：原理、方法与意义
一、 引言
厌氧亚硫酸盐还原菌（Anaerobic Sulfite-Reducing Bacteria, 简称 ASR 菌）是一类能够在厌氧条件下，将培养基中的亚硫酸盐还原为硫化氢（H₂S）的细菌。其中，产孢梭菌（Clostridium sporogenes）是该类群中最具代表性的菌种之一，常被用作生物指示剂来验证灭菌工艺（特别是湿热灭菌）的有效性。尽管并非所有 ASR 菌都是严格意义上的致病菌，但作为一类重要的耐热、厌氧芽孢菌，其存在情况是评价产品（尤其是药品、食品、医疗器械）无菌保障水平或灭菌效果、生产过程卫生控制状况的关键指标。
二、 检测意义
- 灭菌工艺验证（生物指示剂）： 产孢梭菌等 ASR 菌的芽孢对热（尤其是湿热）、辐射等灭菌方式具有很高的抵抗力，常被制成标准的生物指示剂。通过检测灭菌后生物指示剂中 ASR 菌是否被杀灭，可直接证实灭菌工艺的有效性和可靠性。
- 无菌产品保障： 对于最终灭菌的药品（如注射剂、大输液）和医疗器械，以及在特定无菌环境下生产的产品（如非最终灭菌的无菌制剂），检测是否存在 ASR 菌是确认其达到无菌要求的重要手段之一。
- 卫生指示作用： 在食品（特别是罐头类、真空包装食品）、化妆品、原料药等生产过程中，ASR 菌（尤其是其芽孢）的检出可能提示原材料、生产过程或生产环境受到了土壤、水源或粪便的污染，或提示清洁消毒程序存在缺陷。
- 风险评估： ASR 菌中可能包含某些致病性梭菌（如产气荚膜梭菌、肉毒梭菌等），其存在可能带来产品质量和安全风险。
三、 检测原理
ASR 菌检测的核心原理基于其在厌氧条件下还原亚硫酸盐为硫化氢（H₂S）的能力。检测过程通常在专门的液体培养基中进行，该培养基含有：
- 亚硫酸盐源： 通常是亚硫酸钠（Na₂SO₃）或焦亚硫酸钠（Na₂S₂O₅），提供可被还原的亚硫酸根离子（SO₃²⁻）。
- 还原剂与厌氧环境支持： 如硫乙醇酸盐（Thioglycollate），既可作为还原剂消耗培养基中的氧气，创造并维持厌氧环境，也可作为某些细菌的碳源和能源。
- 铁离子指示剂： 常用柠檬酸铁铵（Ammonium Iron(III) Citrate）。当 ASR 菌将亚硫酸盐还原生成 H₂S 时，H₂S 会与培养基中的铁离子（Fe³⁺）反应，生成不溶性的黑色硫化亚铁（FeS）沉淀。
- 营养成分： 如胰酶消化物（Tryptone）、酵母浸出粉（Yeast Extract）等，提供细菌生长所需的氮源、碳源、维生素和矿物质。
- 刃天青（Resazurin）： 常作为氧化还原指示剂。培养基配制后若呈粉色或红色表明含有溶解氧；经加热驱氧冷却后或在厌氧条件下培养时，可还原为无色，指示厌氧状态。
检出判断： 经适宜条件的培养后，若培养基中出现明显的黑色沉淀（FeS），则判定为厌氧亚硫酸盐还原菌检测阳性。
四、 培养基
常用于检测 ASR 菌的培养基是改良的流体硫乙醇酸盐培养基（Modified Fluid Thioglycollate Medium, 简称 mFTM）。
- 基本组成（通用配方参考）：
- 胰酶消化物
- 酵母浸出粉
- 葡萄糖
- 硫乙醇酸钠
- 氯化钠
- L-胱氨酸
- 亚硫酸钠（或焦亚硫酸钠）
- 柠檬酸铁铵
- 刃天青
- 琼脂（少量，用于限制对流，稳定氧梯度）
- 纯化水
- 制备要点：
- 按比例称量各成分（不含亚硫酸盐和柠檬酸铁铵），溶于水中，微温溶解。
- 调节 pH 至灭菌后约为 7.1 ± 0.2（通常灭菌前 pH 约为 7.2-7.4）。
- 加入亚硫酸盐和柠檬酸铁铵（溶解后过滤除菌加入，或在培养基灭菌后冷却至约 50°C 时无菌加入）。
- 分装至适宜的容器（如试管）。
- 采用湿热灭菌法（121°C，15分钟）灭菌。
- 灭菌后迅速冷却，避免过度受热导致亚硫酸盐分解或氧化。
- 培养基应为浅琥珀色或浅黄色，上层可能有少量粉红色（刃天青氧化态），但整个培养基应具有良好的还原性（大部分无色）。
五、 检测方案
典型的检测方案遵循无菌检查的基本原则：
- 样品处理与接种：
- 根据产品类型（液体、固体、非水溶性、医疗器械等）和检测目的（灭菌验证、无菌检查、卫生监测），采用适宜的方法进行样品的前处理（如溶解、分散、均质、淋洗等）。
- 将处理后的样品或其稀释液，按规定的体积（或数量）无菌操作接种到装有 mFTM 培养基的容器中。
- 通常需要进行梯度稀释（如 10⁻¹, 10⁻² 等），以避免产品中可能存在的抑菌物质干扰细菌生长，并有助于定量（MPN法）。
- 每个样品或稀释度应设置足够数量的平行管（通常至少 2 管）。
- 阳性对照（Critical）：
- 在每批试验中，必须同时设立阳性对照。
- 通常选用 产孢梭菌（Clostridium sporogenes）孢子悬液作为标准阳性对照菌。将该菌悬液（菌落数 ≤ 100 CFU）接种到另一管 mFTM 培养基中。
- 阳性对照管在培养期间必须呈现典型的阳性反应（黑色沉淀），证明培养基支持 ASR 菌生长且检测系统有效。
- 阴性对照（可选但推荐）：
- 设立一管未接种的 mFTM 培养基作为阴性对照。
- 该管在整个培养期间应保持澄清或仅有培养基固有颜色，无黑色沉淀产生，以排除培养基自身变质或污染导致的假阳性。
- 培养：
- 将接种后的培养基置于厌氧培养条件下（如厌氧培养箱、厌氧罐，或使用导管法）。
- 培养温度： 通常为 30-35°C。根据特定标准或产品要求（如药典），有时也使用 20-25°C 或 37°C。
- 培养时间： 通常为 不少于 48 小时。对于无菌检查或灭菌验证，推荐培养 不少于 14 天，以确保缓慢生长的菌株也能被检出。生物指示剂验证则按产品说明书要求（通常 24-48 小时）。培养期间可定期（如第 3, 7, 14 天）观察结果。
- 结果观察与判读：
- 阴性： 培养基保持澄清或仅有培养基固有颜色（浅琥珀色/黄色），无黑色或深灰色沉淀出现。
- 阳性： 培养基中出现黑色或深灰色沉淀（硫化亚铁）。沉淀可能均匀分布、聚集在底部或附着在容器壁。浑浊本身不是阳性判据，黑色沉淀是关键。
- 可疑/不确定： 若培养基颜色改变（如变浅、变灰）但无明显黑色沉淀，或沉淀颜色不典型，需转种至新鲜 mFTM 培养基继续培养观察或进行确认试验（如染色镜检、生化鉴定）。
- 定量（MPN法 - 最可能数法，适用于菌落计数）：
- 当进行定量检测时（如原料、水的污染水平评估），通常设置 3-5 个连续稀释度，每个稀释度接种 3-5 管。
- 根据各稀释度出现阳性反应的管数，查 MPN 表即可估算样品中 ASR 菌的最可能数量（以 CFU/g 或 CFU/mL 表示）。
六、 关键注意事项
- 培养基质量控制： 使用前需确认培养基的促生长能力（适用性检查）。新配制批号的培养基应用标准菌株（如产孢梭菌）进行验证，应能支持其良好生长并产生典型的阳性反应（黑色沉淀）。同时需检查无菌性（阴性对照）和 pH。
- 严格的厌氧环境： 确保在整个培养过程中维持有效的厌氧条件至关重要。厌氧罐或厌氧袋需使用有效的产气袋或气体置换方法。刃天青指示剂应呈无色（底部或全部）。
- 避免氧化： 培养基灭菌后应尽量减少暴露于空气的时间，尽快冷却和使用或储存于厌氧环境中。含有亚硫酸盐和柠檬酸铁铵的培养基不应过度加热或反复灭菌。
- 样品代表性及干扰排除： 确保样品处理充分、均匀。对于具有抑菌性的样品（如抗生素、防腐剂），必须采用有效的稀释法、中和法、离心洗涤法或薄膜过滤法来消除干扰。薄膜过滤法需注意选择能有效截留细菌（尤其是芽孢）且不吸附待测菌的滤膜。
- 防止交叉污染： 整个操作过程必须在无菌环境下（如生物安全柜、超净工作台）严格按照无菌操作规程进行。
- 培养温度与时间： 严格遵守规定的培养温度和时间。温度过高可能抑制某些菌株，过低则延长生长周期。培养时间不足可能导致假阴性。
- 结果判读准确性： 仔细观察黑色沉淀的形成，与培养基浑浊、颗粒悬浮物或其他颜色变化区分开。不确定时务必进行复测或确认。
七、 结论
厌氧亚硫酸盐还原菌检测是一项基于特定生化反应（亚硫酸盐还原产 H₂S）的经典微生物学方法，其核心在于利用改良流体硫乙醇酸盐培养基（mFTM）在严格厌氧条件下培养样品。该检测对于验证灭菌工艺有效性（生物指示剂）、保障无菌产品安全、评估生产环境卫生状况具有不可替代的重要作用。检测结果的可靠性高度依赖于严格遵循标准操作规程，特别是对培养基质量、厌氧条件的控制和结果的准确判读。通过规范的操作和对关键因素的把控，厌氧亚硫酸盐还原菌检测能有效服务于医药、食品、化妆品等相关行业的质量控制和风险管理。