DIA定量与检测

DIA定量与检测：核心价值与应用重点（聚焦检测项目）

DIA（数据非依赖采集，Data-Independent Acquisition）是现代质谱蛋白质组学中革命性的技术。它最大的优势在于提供高度重现性、无偏性的全系统范围内蛋白质定性与定量分析。DIA的核心价值在于其检测能力，让我们深入探讨其核心检测项目与应用方向。

DIA核心检测流程简述

1. 样本制备： 从细胞、组织、体液（血液、尿液、脑脊液等）中提取蛋白质。
2. 酶解： 通常使用胰蛋白酶将蛋白质消化成肽段混合物。
3. 色谱分离： 肽段混合物通过高效液相色谱（HPLC/NanoLC）进行分离，降低复杂度。
4. DIA质谱数据采集：
   • 循环扫描： 仪器按预设的循环进行扫描。
   • 全扫描： 在一个循环开始时进行高分辨、高精度的MS1全扫描，记录所有进入质谱的肽段母离子及其强度（用于定量）。
   • 隔离窗口扫描： 将整个质荷比（m/z）范围分割成连续的、固定宽度的“隔离窗口”（例如，26个窗口覆盖400-1000 m/z）。依次、无差别地碎裂并采集每个窗口内所有母离子产生的碎片离子（MS2谱图）。不再依赖母离子强度或预设列表进行选择。
5. 数据分析：
   • 谱图库构建/选择： 需要参考谱图库（可由DDA数据或公共数据库构建）或使用无库方法。
   • 谱图解卷积与定量： 利用软件（如Spectronaut, DIA-NN, Skyline, OpenSWATH）将复杂的混合MS2谱图分解，识别对应肽段/蛋白质，并从MS1或MS2碎片离子峰提取峰面积进行定量。

核心检测项目与应用方向（重点）

DIA技术的强大之处在于它能全面、无偏、可重现地检测和分析以下关键项目：

1. 蛋白质组：

   • 全蛋白质组覆盖： 这是DIA最核心的应用。它能同时检测和定量样本中数千至上万种蛋白质。
   • 高精度定量： 特别擅长发现不同样本组（如疾病vs健康、处理vs对照、不同时间点）之间的差异表达蛋白质。这对于：
     • 生物标志物发现： 在血液、尿液、组织等中寻找疾病诊断、预后或疗效预测的标志物。
     • 机制研究： 理解药物作用机制、基因敲除/过表达效应、环境刺激响应等生物学过程中的关键蛋白变化。
     • 通路分析： 识别受调控的关键信号通路、代谢通路。
     • 大样本队列研究： DIA的高重现性使其成为大型临床队列或时间序列研究的理想选择。

2. 翻译后修饰组：

   • 全局PTM分析： DIA可以同时检测多种类型的翻译后修饰（PTM），无需为每种修饰单独设计实验。关键PTM类型包括：
     • 磷酸化： 检测激酶活性、信号转导状态的核心修饰。需要富集或特殊方法提升覆盖度。
     • 糖基化： 与免疫识别、细胞粘附、疾病状态密切相关的复杂修饰。
     • 乙酰化/甲基化： 在表观遗传调控、转录调控中起重要作用。
     • 泛素化/SUMO化： 调控蛋白质稳定性、定位和相互作用。
   • 修饰位点定位： 通过分析MS2碎片离子谱图，可以精确定位修饰发生的特定氨基酸残基。
   • 修饰水平定量： 定量特定修饰位点的丰度变化，揭示其动态调控。

3. 相互作用组：

   • 亲和纯化-质谱（AP-MS）结合DIA： DIA显著提升了AP-MS实验的可靠性和通量。它能更准确、更全面地鉴定和定量与“诱饵”蛋白相互作用的“猎物”蛋白（互作蛋白）。
   • 共纯化污染物识别： DIA的高重现性有助于区分真实互作蛋白与非特异性结合的背景蛋白。

4. 多组学整合：

   • 蛋白基因组学： 将DIA蛋白质组数据与基因组（如突变、拷贝数变异）、转录组数据进行整合分析，揭示从基因变异到最终蛋白表型的复杂调控关系（如癌症研究）。
   • 代谢组-蛋白质组： 结合代谢物变化与调控代谢通路的酶蛋白变化，理解系统代谢调控。
   • 整合其他组学： 与表观组、脂质组等数据进行联合分析，构建更全面的生物学图景。

5. 代谢组与小分子：

   • 非靶向代谢组学： DIA模式也可应用于小分子分析，进行无偏的代谢物检测和相对定量，发现差异代谢物。但灵敏度和特异性可能不如靶向MRM方法。

关键检测样本类型

• 细胞系： 基础研究、药物筛选模型。
• 动物/植物组织： 疾病模型、发育研究、作物研究。
• 临床样本：
  • 新鲜冷冻组织： 肿瘤研究、病理研究金标准。
  • 福尔马林固定石蜡包埋组织： 利用珍贵临床存档样本进行回顾性研究（需要特殊前处理）。
  • 体液： 血液/血浆/血清（最常用）、尿液、脑脊液、唾液、泪液等（用于无创或微创标志物发现）。
• 微生物： 细菌、真菌、病毒感染的宿主反应或病原体蛋白分析。

检测流程关键点影响检测项目质量

• 样本制备与酶解均一性： 直接影响蛋白/肽段回收率和后续定量的准确性。
• 色谱分离重现性： 保证肽段洗脱时间（Retention Time）稳定，是DIA数据分析（比对谱图库）的关键坐标。
• 质谱参数优化： 隔离窗口大小、数量、碰撞能量、扫描速度等直接影响检测覆盖度、灵敏度和定量精度。
• 高质量谱图库： 对基于库的方法至关重要。覆盖目标样本类型的深度DDA库或公共库（如ProteomeTools, Plasma Proteome Project）是基础。无库方法（如DIA-NN）减少了对库的依赖。
• 强大的数据分析软件： 解卷积复杂MS2谱图、准确鉴定肽段/蛋白质、可靠定量的核心。

总结

DIA技术的核心价值在于其强大、全面、可重现的检测能力。它不再是“钓鱼”（仅检测预设目标），而是“撒网”（系统性地检测所有可检测物）。其核心检测项目覆盖了蛋白质组、翻译后修饰组、相互作用组等核心生命分子层面，并有力支撑多组学整合研究。这使得DIA成为现代生物医学研究、药物发现、临床转化研究中不可或缺的强大工具，尤其在需要无偏性、高覆盖度、高重现性定量的大型或复杂研究中具有不可替代的优势。随着仪器灵敏度、扫描速度和数据分析算法的不断进步，DIA的检测深度、精度和应用范围将持续扩展（如单细胞蛋白质组学）。深度学习等人工智能方法的引入，将进一步挖掘DIA数据中隐藏的生物信息，提升检测效能。