TMT标记定量蛋白质组学：核心检测项目详解
一、 核心检测项目流程
1. 样本制备与质量控制
- 蛋白质提取： 裂解组织/细胞，使用RIPA或尿素缓冲液提取总蛋白。
- 浓度测定： BCA/Lowry法测定蛋白浓度，确保样本均一性。
- 还原烷基化： DTT还原二硫键，碘乙酰胺烷基化防止重氧化。
- 酶解： Trypsin酶切（37℃，过夜）生成肽段混合物。
- 脱盐： C18柱去除盐分和杂质，提高质谱灵敏度。
2. TMT标记反应
- 试剂选择： 根据样本数量选用TMT试剂盒（6/10/11/16重）。
- 标记反应： 激活的TMT试剂与肽段N端及赖氨酸侧链反应（室温，1小时）。
- 反应淬灭： 加入羟胺终止反应。
- 混合样本： 等量混合所有标记样本，形成单一检测样本。
3. 肽段分级（降低复杂度）
- 高pH反相色谱： 根据疏水性将肽段分为10-15组分（关键步骤）。
- SCX色谱： 替代方案，基于电荷分离肽段。
- 目的： 降低单次质谱进样的复杂度，提高低丰度蛋白检出率。
4. 液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）分析
- 纳升液相色谱： C18色谱柱分离肽段（梯度：5-35%乙腈/60-120分钟）。
- 高分辨质谱仪：
- 一级扫描（MS1）： Orbitrap检测肽段母离子（分辨率≥60,000）。
- 二级扫描（MS2/MS3）：
- MS2： 选择母离子碎裂（HCD），产生报告离子（低m/z区）及碎片离子。
- MS3（推荐）： 对MS2碎片离子再碎裂，消除共洗脱肽段干扰，显著提高定量准确性。
5. 数据处理与生物信息学分析
- 数据库搜索：
- 工具：MaxQuant, Proteome Discoverer, FragPipe。
- 数据库：UniProt/Swiss-Prot。
- 参数：Trypsin酶切、TMT修饰、固定修饰（半胱氨酸烷基化）、可变修饰（蛋氨酸氧化）。
- 定量分析：
- 提取各通道报告离子强度（MS2或MS3）。
- 计算蛋白相对丰度比值（如处理组/对照组）。
- 校正：基于总肽段强度或参考通道进行归一化。
- 差异表达分析：
- 工具：Perseus, R包（limma, DEP）。
- 方法：t检验/ANOVA（p值），Benjamini-Hochberg法校正多重假设。
- 阈值：Fold change ≥ 1.5 且 p.adj < 0.05。
- 功能注释与通路分析：
- GO注释（生物学过程、分子功能、细胞组分）。
- KEGG/Reactome通路富集分析（超几何分布检验）。
- 蛋白互作网络构建（STRING数据库 + Cytoscape可视化）。
二、 检测项目选择关键点
三、 典型检测报告输出内容
- 实验流程总结： 样本信息、标记方案、质谱仪参数、分析方法。
- 质控指标：
- 总蛋白/肽段鉴定数量
- 标记效率（>98%）
- 各通道信号强度分布（箱线图）
- 主成分分析（PCA）样本聚类评估
- 差异表达结果：
- 差异蛋白列表（含FC、p值、p.adj值）
- 火山图（差异表达可视化）
- 热图（表达模式聚类）
- 功能分析结果：
- GO富集气泡图（关键生物学过程）
- KEGG通路富集柱状图（显著调控通路）
- 蛋白互作网络图（核心枢纽蛋白）
四、 技术优势与局限
- 优势：
- 高通量： 单次实验平行比较16样本。
- 高精度： 内标校正降低技术误差，尤其MS3模式。
- 样本兼容广： 组织、细胞、体液、植物样本均可分析。
- 局限：
- 成本高： 试剂与质谱机时成本显著。
- 通道数限制： 最大16重（TMTpro），超量样本需分批实验。
- “比值压缩”： 复杂样本中定量动态范围可能受限。
五、 应用场景实例
- 疾病机制： 癌症vs正常组织差异蛋白筛选，寻找生物标志物。
- 药物开发： 药物处理细胞后通路变化分析，揭示作用机制。
- 植物抗逆： 干旱/盐胁迫下植物蛋白表达谱动态研究。
- 微生物研究： 不同培养条件下细菌关键代谢通路蛋白变化。
总结
TMT定量蛋白质组学的核心检测项目是一个整合了精密实验操作与高级生物信息学的系统性流程。从样本制备到功能解析，每一步的设计（如是否分级、采用MS2/MS3模式）均直接影响数据质量和生物学结论的可靠性。研究者需根据样本规模、复杂性及预算，在通量与精度之间找到最佳平衡点。随着自动化与算法的发展，TMT技术将继续推动蛋白质组学在精准医学与生命科学中的深度应用。
最终报告示例（部分）：
图：差异蛋白火山图（左）与表达聚类热图（右）