黄曲霉素M1、B1、B2、G1、G2检测

黄曲霉素M1、B1、B2、G1、G2检测技术概述

一、引言

黄曲霉素（Aflatoxins）是由黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）等真菌产生的强毒性、强致癌性次级代谢产物。其中，B1、B2、G1、G2主要污染玉米、花生、坚果、棉籽等农作物及其制品，而M1则是B1在哺乳动物体内的主要羟基化代谢产物，主要存在于被污染动物（如奶牛）的乳汁及其制品（牛奶、奶酪等）中。由于其极高的毒性（B1被IARC列为1类致癌物）和潜在的广泛污染风险，建立灵敏、准确、高效的检测方法对保障食品安全和人类健康至关重要。

二、主要黄曲霉素种类及其特性

1. 黄曲霉素B1 (AFB1)： 致癌性和毒性最强，是污染最普遍的种类，也是其他类型（如M1）的前体。
2. 黄曲霉素B2 (AFB2)： 结构与B1相似，但毒性较B1低，常与B1共存。
3. 黄曲霉素G1 (AFG1)： 毒性低于B1，但也是强致癌物，荧光颜色为绿色（G代表Green）。
4. 黄曲霉素G2 (AFG2)： 毒性低于G1，结构与G1相似，常与G1共存，荧光为绿色。
5. 黄曲霉素M1 (AFM1)： B1在动物肝脏中的主要代谢产物，经乳汁排泄。其毒性与致癌性约为B1的十分之一，但在乳制品中残留对婴幼儿等敏感人群风险尤高。

三、样品前处理

准确检测的关键在于有效地将痕量目标物从复杂的食品基质中提取、净化并富集。

1. 提取：
   • 常用溶剂： 乙腈-水溶液、甲醇-水溶液（常用比例70:30, 80:20）、或含酸（如甲酸）的乙腈/甲醇水溶液。选择依据基质和目标物溶解度。
   • 辅助手段： 高速均质、振荡、超声辅助提取可提高效率。
2. 净化： 去除油脂、色素、蛋白质等基质干扰。
   • 免疫亲和柱净化(IAC)： 最常用且效果最佳的方法。 利用抗原抗体特异性结合原理，选择性吸附目标黄曲霉素，洗脱干扰物后再洗脱目标物。具有高选择性、高净化效率。
   • 固相萃取(SPE)： 使用C18、Florisil（硅镁吸附剂）、多功能净化柱等填料进行净化，成本较低，但特异性可能不如IAC。
   • QuEChERS法： 快速、简便、廉价、有效（Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe）。常用于多组分农药残留检测，经改进后也适用于霉菌毒素分析。主要步骤为乙腈提取后加入无水MgSO₄和NaCl（或缓冲盐）进行盐析，使用PSA（乙二胺基-N-丙基）、C18、GCB（石墨化炭黑）等吸附剂净化提取液上清。
3. 浓缩与复溶： 净化后的洗脱液通常需要氮吹浓缩至近干，再用初始流动相或较小体积溶剂复溶，以提高目标物浓度，满足仪器检测限要求。

四、主要检测技术

1. 液相色谱法(HPLC)：

   • 原理： 利用目标物在色谱柱固定相与流动相之间的分配差异进行分离。
   • 检测器：
     • 荧光检测器(FLD)： 最常用的检测器。 B1、B2、G1、G2、M1本身具有荧光特性，但G1和B1的荧光强度较弱。为提高灵敏度和选择性，常在柱前或柱后进行衍生化：
       • 柱前衍生： 如三氟乙酸(TFA)衍生（针对B1、G1）生成强荧光衍生物。
       • 柱后衍生：
         • 碘衍生法： 使用碘溶液衍生。
         • 电化学衍生（库伦阵列）： 更环保、高效。
     • 紫外/二极管阵列检测器(UV/DAD)： 灵敏度低于FLD，一般作为辅助或确证手段。
   • 特点： 成熟、稳定、应用范围广，是许多国家标准方法的基础。

2. 液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)：

   • 原理： HPLC分离后，目标物进入质谱离子源电离，经多级质量分析器筛选特征离子进行定性和定量。
   • 优势：
     • 高灵敏度与高选择性： 能有效排除基质干扰，降低假阳性/阴性风险。
     • 无需衍生： 直接检测目标物本身或其加合离子。
     • 多组分同时检测： 可同时检测多种毒素及其代谢物。
     • 确证能力强： 通过母离子和特征子离子进行定性，结果更可靠。
   • 应用： 已成为黄曲霉素检测，特别是痕量分析、复杂基质分析和确证检测的金标准和发展趋势。

3. 酶联免疫吸附法(ELISA)：

   • 原理： 基于抗原抗体特异性结合反应，通过酶催化底物显色进行定性或半定量/定量分析。
   • 形式： 试剂盒（微孔板或试纸条）。
   • 优点： 操作相对简便、快速、成本较低、可大批量筛选。
   • 缺点： 易受基质干扰，可能出现假阳性/假阴性；通常只能检测单一或一类毒素（如总量检测）；精密度和准确性低于色谱方法。适用于现场快速筛查，阳性结果需用色谱法确证。

4. 薄层色谱法(TLC)：

   • 传统方法，操作繁琐，灵敏度、准确性、重现性较差，需要衍生化，在现代实验室中已逐渐被HPLC和LC-MS/MS取代。

五、法规限量与质量控制

1. 限量标准： 世界各国对食品和饲料中的黄曲霉素（特别是B1、总和M1）制定了严格的限量标准。例如：

   • 中国： GB 2761-2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》规定了玉米、花生及其制品、油脂及其制品、调味品（酱油、醋等）、婴幼儿配方食品等中B1、B1+B2+G1+G2总量的限量（如玉米中B1 ≤ 20 μg/kg，总量 ≤ 20 μg/kg）；乳及乳制品中M1 ≤ 0.5 μg/kg。
   • 欧盟： 限量标准更为严格（如供人直接食用的花生中B1 ≤ 2 μg/kg，总量 ≤ 4 μg/kg；原料奶、热处理奶及奶制品中M1 ≤ 0.05 μg/kg）。

2. 质量控制：

   • 方法验证： 对新建立或采用的方法必须进行验证，包括线性范围、检出限(LOD)、定量限(LOQ)、精密度（重复性、再现性）、准确度（加标回收率）、特异性等指标。
   • 标准物质： 使用经认证的有证标准物质(CRM)进行校准和质量控制。
   • 空白与加标实验： 每批样品分析需包含空白样品、加标样品（低、中、高水平）以监控污染、基质效应和回收率。
   • 能力验证： 定期参加权威机构组织的能力验证计划(PT)，评估实验室检测能力。
   • 标准操作程序(SOP)： 严格执行规范化的操作流程。

六、结论

黄曲霉素M1、B1、B2、G1、G2的检测是食品安全监测的重要环节。基于免疫亲和柱净化结合高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD)或液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)是目前主流的、满足法规要求的精准检测技术。酶联免疫法(ELISA)适用于快速筛查。随着检测需求的不断提高和技术的进步，LC-MS/MS凭借其卓越的性能在多毒素高通量检测、痕量分析和复杂基质分析中发挥着越来越核心的作用。严格的质量控制体系和遵循相关法规限量标准是保障检测结果准确可靠、有效控制黄曲霉素污染风险的必要条件。持续的检测技术创新和方法标准化对于保护消费者健康和促进国际贸易至关重要。

附录：常见缩写

• AFB1: 黄曲霉素B1
• AFB2: 黄曲霉素B2
• AFG1: 黄曲霉素G1
• AFG2: 黄曲霉素G2
• AFM1: 黄曲霉素M1
• HPLC: 高效液相色谱
• FLD: 荧光检测器
• LC-MS/MS: 液相色谱-串联质谱
• IAC: 免疫亲和柱
• SPE: 固相萃取
• QuEChERS: 快速、简便、廉价、有效、耐用、安全（的样品前处理方法）
• TFA: 三氟乙酸
• ELISA: 酶联免疫吸附法
• TLC: 薄层色谱
• LOD: 检出限
• LOQ: 定量限
• CRM: 有证标准物质
• SOP: 标准操作程序
• PT: 能力验证