金黄色葡萄球菌检测

金黄色葡萄球菌检测：方法与意义

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），简称金葡菌，是一种广泛存在于自然环境和人体体表（如鼻腔、皮肤）的革兰氏阳性球菌。它既是人体常见的共生菌，也是重要的条件致病菌。金葡菌能产生多种毒素（如肠毒素、中毒性休克综合征毒素-1 TSST-1、剥脱毒素、杀白细胞素等）和侵袭性酶（如血浆凝固酶、耐热核酸酶等），使其致病力强大。其检测在医疗健康、食品安全、环境卫生等多个领域至关重要。

一、 金黄色葡萄球菌的危害

1. 医院感染： 是重要的医院感染病原体之一，可导致：
   • 皮肤软组织感染： 疖、痈、脓肿、伤口感染、烫伤样皮肤综合征。
   • 血流感染： 菌血症、败血症、感染性心内膜炎（尤其与静脉导管相关）。
   • 肺炎： 社区获得性肺炎（CAP）和医院获得性肺炎（HAP），尤其是流感后或机械通气患者。
   • 骨关节感染： 骨髓炎、化脓性关节炎。
   • 中毒性休克综合征： 主要由TSST-1或肠毒素引起。
2. 食源性疾病： 污染食物的金葡菌在适宜条件下（尤其温度在10-45℃，pH>4.5）能分泌耐热的肠毒素（SEs）。摄入含肠毒素的食物（无需活菌存在）可导致急性的呕吐、腹泻、腹痛等食物中毒症状。常见于被污染后未充分加热的乳制品、肉制品、禽类制品、沙拉、糕点等。
3. 社区感染： 如毛囊炎、蜂窝组织炎等皮肤感染。
4. 耐药性问题： 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的出现和传播，使得治疗变得极其困难，已成为全球公共卫生的重大威胁。此外，万古霉素中介/耐药金葡菌（VISA/VRSA）也时有报道。

二、 金黄色葡萄球菌的重要生物学特性（与检测相关）

• 形态与染色： 革兰氏阳性球菌，呈葡萄串状排列。
• 培养特性：
  • 需氧或兼性厌氧。
  • 营养要求不高，在普通培养基上生长良好。
  • 最适生长温度35-37℃；最适pH 7.4-7.6。
  • 普通琼脂平板：形成圆形、凸起、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明的菌落。不同菌株可产生不同色素（脂溶性色素），典型菌落呈金黄色（故名），也有白色、柠檬色。
  • 血琼脂平板：多数菌株产生溶血毒素，在菌落周围形成明显的完全溶血环（β溶血）。
• 关键生化特性（鉴定依据）：
  • 血浆凝固酶： 大多数致病性金葡菌（约95%）产生此酶，能使含有抗凝剂（如枸橼酸盐）的人或兔血浆发生凝固（试管法或玻片法）。这是区分致病性金葡菌与其他凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）的最重要指标之一。
  • 耐热核酸酶： 能耐受煮沸数分钟仍保持活性，分解DNA。多数金葡菌产生此酶，是快速鉴别的重要指标（如甲苯胺蓝-DNA平板法）。
  • 发酵甘露醇： 在含甘露醇和高盐的选择性培养基（如甘露醇氯化钠琼脂）上，多数致病株能发酵甘露醇产酸，使培养基变黄。
  • 触酶试验阳性： 产生过氧化氢酶，与链球菌区分。

三、 金黄色葡萄球菌的检测方法

检测目标通常包括：

1. 定性检测（样品中是否存在金葡菌？）
2. 定量检测（样品中金葡菌的数量是多少？ - 通常用于食品、环境样品评估污染程度）
3. 菌株鉴定（确认是否为金葡菌）
4. 毒素检测（特别是食品中的肠毒素）
5. 耐药性检测（如MRSA筛查）

常用检测方法可分为传统培养法、免疫学方法和分子生物学方法三大类。

1. 传统培养法（金标准） * 原理： 利用金葡菌的生长特性和生物化学特性进行分离培养和鉴定。 * 基本流程： * 样品处理： 根据样品类型（食品、环境拭子、临床标本等）进行均质、稀释等预处理。 * 增菌培养： 对于含菌量可能较低的样品或需要提高检测灵敏度时使用。常用含7.5%-10% NaCl的肉汤培养基（如营养肉汤、胰酪胨大豆肉汤），利用金葡菌耐高渗透压的特性抑制大多数竞争菌生长。培养18-24小时（35-37℃）。 * 选择性分离培养： * Baird-Parker琼脂平板： 最常用的选择性培养基之一。含丙酮酸钠、甘氨酸、亚碲酸钾（抑制革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌）和卵黄乳液。典型金葡菌菌落呈黑色、光滑、凸起、湿润，周围有不透明圈（因还原亚碲酸钾）和清晰带（因卵磷脂酶分解卵磷脂）。需进一步验证。 * 甘露醇氯化钠琼脂平板： 含甘露醇和7.5% NaCl。能发酵甘露醇的金葡菌菌落呈黄色，周围培养基变黄（产酸）。 * 血琼脂平板： 非选择性，但有助于观察溶血特征（多数致病株β溶血）。 * 纯化与初步鉴定： 挑取可疑菌落纯化，进行革兰氏染色（确认革兰氏阳性葡萄状球菌）、触酶试验（阳性）。 * 凝固酶试验（关键鉴定步骤）： * 玻片法： 快速筛选。菌落与一滴兔血浆混合，立即或10秒内出现凝集为阳性（推测凝固酶阳性）。 * 试管法： 确认试验。菌落接种于含0.5ml兔血浆的试管，35-37℃培养4-24小时（通常4-6小时观察）。凝固成胶冻状为阳性（血浆凝固酶阳性）。玻片法阳性或可疑者必须用试管法确认。 * 耐热核酸酶试验： 快速辅助鉴定。细菌培养物煮沸后点种于含甲苯胺蓝的DNA琼脂平板孔中，35-37℃培养4小时。孔周围出现粉红色晕圈为阳性（耐热核酸酶阳性）。此法快速，常与其他方法联用。 * 其他生化试验： 如API Staph等商品化鉴定系统可用于更全面的生化鉴定（尤其对凝固酶阴性或结果不明确菌株）。 * 定量检测： 通常采用平板计数法。将适当稀释度的样品（或增菌液）涂布或倾注于Baird-Parker或甘露醇氯化钠平板，培养后计数典型或验证后的菌落数，乘以稀释倍数报告CFU/g或CFU/mL。

2. 免疫学方法 * 原理： 利用抗原（金葡菌表面抗原或分泌的肠毒素）与特异性抗体结合的特性进行检测。 * 常见类型： * 乳胶凝集试验： 最常用。将包被有抗金葡菌特异性抗原（如凝固酶、蛋白A、细胞壁成分）或特异性抗肠毒素抗体的乳胶颗粒，与待测菌落悬液或增菌液混合。若存在相应抗原，则发生肉眼可见的凝集反应。常用于快速鉴定纯培养物（替代或补充凝固酶试验）或检测肠毒素。 * 酶联免疫吸附试验： 用于检测样品（如食品提取物、培养上清液）中的金葡菌肠毒素（SEs）。特异性强，灵敏度高，可定量或半定量。有商品化试剂盒。 * 免疫层析试纸条： 侧向流免疫层析技术。快速（通常10-30分钟出结果），操作简便（类似验孕棒），无需特殊设备。常用于现场快速筛查食品、环境样品中的金葡菌或肠毒素，或对培养后的可疑菌落进行快速确认。灵敏度一般低于培养法或ELISA。 * 优点： 快速（尤其凝集和试纸条）；操作相对简单（部分可现场使用）；适合大批量样品筛查（ELISA）；灵敏度高（ELISA）。 * 缺点： 主要检测抗原或毒素，不能区分死菌活菌（除非结合培养）；可能受样品基质干扰产生假阳性/假阴性；无法获得活菌株进行后续分析（除非是菌落鉴定）；试剂成本较高。

3. 分子生物学方法 * 原理： 检测金葡菌特异性的DNA或RNA片段（靶基因）。 * 常见类型： * 聚合酶链式反应： 最常用。针对金葡菌特异性基因（如编码耐热核酸酶的nuc基因、凝固酶的coa基因、16S rRNA基因片段、MRSA相关的mecA基因等）设计引物进行扩增。通过凝胶电泳或实时荧光定量PCR检测扩增产物。 * 实时荧光定量PCR： 在封闭管中进行PCR扩增，同时通过荧光信号实时监测扩增产物量，速度快（2-4小时），灵敏度高，可定量（需标准品），可同时检测多个靶标（如金葡菌特异性基因+mecA用于MRSA筛查）。 * DNA分子杂交： 使用标记的核酸探针与样品中提取的DNA进行特异性结合检测。 * 优点： 速度最快（尤其qPCR）；灵敏度极高（可检出极低拷贝数的靶基因）；特异性强；可检测不易培养的菌或受损菌；可同时检测多种靶标（如病原体鉴定、毒力基因、耐药基因如mecA）。 * 缺点： 设备昂贵（尤其qPCR）；对实验环境（防污染）和操作人员要求高；不能区分死菌活菌（除非使用mRNA靶标）；检测结果阳性仅表明存在目标DNA片段，不一定代表有活菌或其具有表达的致病性；成本高；无法获得活菌株。

4. 其他方法 * 显色培养基： 在选择性培养基基础上添加特殊底物和显色剂。金葡菌产生的特异性酶分解底物，使菌落呈现特定的颜色（如紫色、绿色、蓝绿色）。能直观地将金葡菌与其他菌区分开，显著缩短鉴定时间（通常在培养24小时内即可根据颜色初步判断）。常与传统确认试验联用。 * 自动化/半自动化鉴定系统： 利用生化反应、质谱分析（如MALDI-TOF MS）等技术进行快速鉴定。MALDI-TOF MS通过分析细菌蛋白指纹图谱，可在几分钟内对纯培养物进行准确种水平鉴定，包括金葡菌，速度远超传统生化方法。

四、 方法选择与检测策略

• 医疗临床标本：
  • 常规培养鉴定： 血平板分离 -> 触酶阳性、凝固酶阳性 -> 报告金黄色葡萄球菌。药敏试验（特别关注MRSA）。
  • 快速筛查（如MRSA）： 针对高危患者入院鼻拭子筛查，常用快速分子检测（PCR检测sccmec片段+耐药基因）或免疫层析法。
  • 无菌体液/组织： 快速分子检测可缩短报告时间。
  • 疑似食物中毒患者标本： 除检测病原菌外，必要时检测呕吐物或粪便中的肠毒素。
• 食品检测：
  • 定性： 通常采用增菌培养法（如BP增菌肉汤） -> Baird-Parker平板分离 -> 凝固酶试验确认。也可采用快速检测法（免疫法、PCR法）进行初筛，阳性者再用培养法确认。
  • 定量： 平板计数法（Baird-Parker或显色平板）。
  • 肠毒素检测： 对于引起食物中毒的可疑食品，需额外检测肠毒素（ELISA、免疫层析法）。培养检出金葡菌并不意味着食品含有肠毒素。
• 环境监测（洁净区、操作台面等）：
  • 表面涂抹采样 -> 增菌培养或直接接种选择性平板 -> 确认鉴定。 也可使用快速试纸条或ATP生物荧光法（作为卫生清洁度指标，非特异性检测金葡菌）进行日常监控。

五、 总结

金黄色葡萄球菌的检测是保障公共卫生安全、食品安全和医疗质量控制的关键环节。传统培养法作为金标准，因其可靠性和能提供活菌株的优势，仍不可替代，尤其用于定量和确证。免疫学方法（如乳胶凝集、ELISA、试纸条）和分子生物学方法（尤其是实时荧光定量PCR）凭借其快速、灵敏、高通量的特点，在快速筛查、毒素检测、耐药性监测等方面发挥着越来越重要的作用。显色培养基和自动化鉴定系统则大大提高了实验室的工作效率和鉴定准确性。选择哪种检测方法或组合策略，需根据检测目的（定性/定量、筛查/确证、活菌/毒素/基因）、样品类型、时效要求、成本预算和实验室条件等因素综合考量。准确、及时的检测结果是有效预防和控制金黄色葡萄球菌感染及其毒素危害的基础。