志贺氏菌检测

发布时间：2025-06-17 08:05:28 阅读量：3 作者：生物检测中心
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志贺氏菌检测：方法与流程详解

一、 志贺氏菌概述

志贺氏菌（Shigella spp.）是引起人类细菌性痢疾（志贺菌病）的主要病原体。该菌属于肠杆菌科，革兰氏阴性杆菌，无芽孢、无荚膜、无鞭毛（无动力）。根据其生化特性和O抗原的不同，主要分为4个血清群（种）：

  • A群： 痢疾志贺氏菌 (S. dysenteriae)，毒力最强，可产生志贺毒素（Shiga toxin），易引起严重疾病甚至溶血性尿毒综合征（HUS）。
  • B群： 福氏志贺氏菌 (S. flexneri)，在发展中国家最常见。
  • C群： 鲍氏志贺氏菌 (S. boydii)。
  • D群： 宋内氏志贺氏菌 (S. sonnei)，在发达国家最常见，引起的症状通常相对较轻。

志贺氏菌主要通过粪-口途径传播，传染性极强（仅需10-100个菌即可致病）。污染的水源、食物（尤其是生食蔬菜、沙拉、乳制品），以及人与人之间的直接接触是主要传播方式。感染后可引起发热、腹部绞痛、里急后重以及腹泻（便中常带血和粘液）。及时、准确的实验室检测对于病例诊断、疫情调查和防控、食品安全保障以及水源监测至关重要。

二、 样本采集与处理

  • 样本类型：
    • 临床样本： 新鲜腹泻粪便（首选，采集后尽快送检）、直肠拭子（适用于不便采集粪便者）。
    • 食品样本： 可疑受污染的即食食品、生鲜果蔬、乳制品等。需无菌操作采集代表性样本。
    • 环境样本： 可疑污染源（如食品加工表面、器具、水源等）的涂抹拭子或水样。
  • 采集与运输：
    • 使用无菌容器或专用运送培养基（如Cary-Blair运送培养基）。
    • 粪便样本量约为1-5克或1-5毫升。
    • 样本应在采集后2小时内送达实验室。若不能及时送检，需冷藏（2-8°C），但不超过48小时（某些培养基可能要求更短时间）。冷冻会降低志贺氏菌的存活率，通常不推荐。
  • 样本预处理：
    • 食品和环境样本通常需要经过特定的前处理（如均质、增菌液的添加）以满足后续检测要求。

三、 主要检测方法

志贺氏菌检测通常采用多种方法组合，以提高检出率和准确性。核心流程包括增菌培养、选择性分离、生化鉴定和血清学鉴定（临床诊断常用）。

  1. 增菌培养

    • 目的： 提高样本中可能存在的少量志贺氏菌的数量，抑制杂菌生长。
    • 培养基：
      • GN增菌肉汤 (Gram Negative Broth)： 常用选择性增菌液。
      • 志贺氏菌肉汤： 专门设计用于志贺氏菌增菌。
    • 方法： 将样本接种到增菌液中，在适宜温度（通常35-37°C）下振荡培养6-24小时（具体时间根据方法和样本类型调整）。

  2. 选择性分离培养

    • 目的： 从增菌液或原始样本中分离出志贺氏菌的单个菌落。
    • 培养基（常用）：
      • 木糖赖氨酸去氧胆酸盐琼脂 (XLD Agar)： 志贺氏菌菌落呈红色或粉红色（不发酵木糖），中心可能呈黑色（如果产生H2S，但大多数志贺氏菌不产生）。沙门氏菌与之类似但有黑心。
      • 麦康凯琼脂 (MacConkey Agar)： 志贺氏菌菌落呈无色或淡粉色（不发酵乳糖或迟缓发酵，如宋内氏菌）。
      • 沙门志贺琼脂 (SS Agar)： 志贺氏菌菌落通常无色透明（有时中心带黑点），乳糖发酵菌呈粉红色。
      • Hektoen肠道琼脂 (HE Agar)： 志贺氏菌菌落呈蓝色或蓝绿色（不发酵乳糖和蔗糖），沙门氏菌与之类似但常有黑心。
    • 方法： 取增菌液或样本悬液划线接种于一种或多种选择性平板，于35-37°C培养18-24小时。观察平板上可疑菌落形态（无色、半透明、光滑、直径约1-3mm）。

  3. 初步筛选与纯化

    • 挑取符合志贺氏菌特征的可疑菌落，接种到非选择性琼脂平板（如营养琼脂、胰酪大豆琼脂/TSA）或三糖铁/克氏双糖铁琼脂（TSI/KIA）斜面进行纯化和初步生化筛选。
    • 三糖铁琼脂 (TSI) / 克氏双糖铁琼脂 (KIA)：
      • 志贺氏菌典型反应：斜面碱性（红色）、底层酸性（黄色）、不产气（底部裂隙无气泡）、不产H2S（无黑色）。
      • 注意： 宋内氏菌和鲍氏志贺氏菌14型可能迟缓发酵乳糖（几天后底层变黄）；某些福氏志贺氏菌6型可产少量气体。

  4. 生化鉴定

    • 纯化后的纯菌落需进行一系列生化试验以鉴定到属（肠杆菌科→志贺氏菌属）和种。
    • 关键生化特征：
      • 氧化酶阴性 (Oxidase -)
      • 不发酵乳糖（宋内氏菌和鲍氏菌14型通常迟缓发酵）
      • 不发酵蔗糖（某些鲍氏菌株可发酵）
      • 不产生赖氨酸脱羧酶 (LDC -)
      • 通常不产生鸟氨酸脱羧酶 (ODC -)（宋内氏菌为阳性ODC+，鲍氏菌13型也阳性）
      • 不产生H2S (TSI中无黑色)
      • 不产生尿素酶 (Urease -)
      • 不利用枸橼酸盐 (Citrate -)
      • 不运动（无动力）
      • 甲基红试验阳性 (MR +)，VP试验阴性 (V-P -)
    • 方法： 可使用传统生化试验管、微量生化鉴定系统或自动化鉴定仪器进行操作和判读。

  5. 血清学分型

    • 目的： 对生化鉴定符合志贺氏菌属的菌株确定其血清群（种）和血清型。这是流行病学调查和溯源的关键。
    • 方法： 使用多价和单价志贺氏菌抗血清（A/B/C/D群）进行玻片凝集试验。
      • 先用志贺氏菌多价血清（包含A/B/C/D群抗体）进行凝集。
      • 若多价凝集阳性，则再用各群单价血清（如抗A群、抗B群…）进行凝集，确定血清群（即种）。
      • 在确定血清群后，有时还需用特定的型因子和群因子血清进行凝集，进一步确定血清型（如福氏志贺氏菌分1a, 2a, 3b等型）。宋内氏菌只有一个血清型，但可分光滑型（I相）和粗糙型（II相）。
    • 要点： 凝集试验需在生理盐水对照无自凝的基础上进行；需使用新鲜纯培养物；凝集反应应在规定时间内观察；注意交叉反应（如与大肠杆菌O抗原）。

  6. 分子生物学检测

    • 原理： 检测志贺氏菌特异的基因片段（如侵袭性质粒抗原H基因 ipaH，该基因在质粒和染色体上均存在，检出率高且稳定；志贺毒素基因 stx 对于痢疾志贺氏菌1型尤为重要）。
    • 常用技术：
      • 聚合酶链式反应 (PCR)： 常规PCR、多重PCR（同时检测志贺氏菌靶基因和其他病原体如沙门氏菌、致病性大肠杆菌基因）、实时荧光定量PCR (qPCR，快速、灵敏度高、可定量）。
      • 等温扩增技术 (如LAMP, RPA)： 快速、简便，有时无需复杂仪器。
    • 优势：
      • 速度快（数小时出结果）。
      • 灵敏度高，可检测死菌或受抑制的菌。
      • 特异性强，能准确区分志贺氏菌和其他近源菌（如侵袭性大肠杆菌EIEC）。
      • 可用于直接检测临床粪便标本（需有核酸提取步骤）或增菌液/可疑菌落。
    • 局限： 需要专业仪器和操作人员；阳性结果仅表明靶基因存在，不代表有活菌或致病菌存在（需结合培养）；成本相对较高；无法直接用于抗菌药物敏感性试验。

  7. 免疫学检测（快速检测）

    • 原理： 利用抗体（单抗或多抗）检测志贺氏菌特异抗原（如脂多糖O抗原）。
    • 常用方法：
      • 酶联免疫吸附试验 (ELISA)： 可用于检测样本（粪便、食品增菌液）中的志贺氏菌抗原。灵敏度、自动化程度较高。
      • 免疫层析试纸条/侧向流免疫层析 (LFIA)： 类似早早孕试纸原理，操作简便、快速（10-30分钟）、无需特殊设备，适用于现场筛查（如基层医疗机构、现场流行病学调查）。
    • 优势： 快速、简便。
    • 局限： 灵敏度通常低于培养和分子方法；特异性可能受交叉反应影响；多为筛查方法，阳性结果通常需要培养或其他方法确证。

四、 结果报告与解读

  • 分离培养+生化+血清学：
    • 如分离到菌株，生化符合志贺氏菌属特征，且与志贺氏菌多价及相应单价血清凝集阳性→报告“检出志贺氏菌 [血清群]（或具体血清型）”。
    • 生化符合志贺氏菌属特征，但血清不凝集→报告“检出志贺氏菌（未分群/未分型）”或“生化鉴定为志贺氏菌，血清凝集阴性”（需进一步研究，可能为罕见血清型或抗原变异）。
  • 分子检测（PCR/qPCR）：
    • 报告特定靶基因（如 ipaH）阳性或阴性。若检测志贺毒素基因（stx），需明确报告。
    • 应注明检测的是核酸（DNA），不区分菌的死活。
  • 免疫学检测（ELISA/LFIA）：
    • 报告抗原检测阳性或阴性。通常作为筛查结果，建议备注“阳性结果需经培养确证”。
  • 阴性结果： 报告“未检出志贺氏菌”。

五、 质量控制与生物安全

  • 质量控制：
    • 培养基质控： 使用前检查平板或肉汤是否污染、干裂；定期用标准参考菌株测试其选择性和生长特性。
    • 试剂质控： 生化试剂、血清（尤其是新开封或长期未使用的批次）需用已知阳性和阴性菌株进行验证。
    • 仪器质控： 自动化仪器按操作规程进行校准和维护。
    • 人员与操作： 操作人员需经过培训；严格遵守标准操作规程（SOP）。
  • 生物安全：
    • 志贺氏菌属于生物安全二级 (BSL-2) 病原体。
    • 所有样本处理和细菌培养操作必须在BSL-2实验室中进行。
    • 操作人员必须穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括实验服、手套、护目镜/面罩（可能产生气溶胶时）。
    • 严格遵循良好微生物操作规范（GMP），防止产生气溶胶、避免皮肤和粘膜接触。
    • 所有废弃物（培养物、污染材料）必须经过有效灭菌（高压蒸汽灭菌）后才能丢弃。

六、 总结

志贺氏菌检测是诊断细菌性痢疾和识别污染源的核心手段。传统方法（增菌→分离培养→生化鉴定→血清分型）仍是实验室诊断的“金标准”，结果直观可靠，并能获得活菌用于分型、药敏试验和深入研究。分子生物学方法（特别是qPCR）因其快速、高灵敏度和高特异性，在临床快速诊断、疫情应急响应和食品/环境监测中发挥着越来越重要的作用。快速免疫学方法适用于现场初步筛查。现代实验室通常采用多种方法组合的策略，以兼顾速度、准确性和成本效益。严格遵守质量控制程序和生物安全规范是确保检测结果准确可靠、保护实验人员及环境安全的前提。随着技术的进步，未来志贺氏菌检测将朝着更快速、更灵敏、更智能（如自动化、多重检测）以及现场即时检测（POCT）的方向发展。

请注意： 具体的检测规程应严格遵循国家或国际认可的标准方法（如ISO方法、CLSI指南、国家食品安全标准GB方法或国家卫生行业病原检测标准WS方法）。检测方法和流程会随着标准的更新而调整。