微生物群落多样性（16S/ITS测序） - 中析研究所生物检测中心

微生物群落多样性检测（16S/ITS测序）：揭示微观世界的奥秘

微生物群落是地球上最庞大、最多样化的生命形式，存在于土壤、水体、人体、动植物体表及内部等几乎一切环境中。它们不仅是生态系统功能的核心驱动者（如物质循环、能量流动），更与人类健康、农业生产、环境修复、工业发酵等息息相关。16S rRNA基因（针对细菌和古菌）和ITS区域（针对真菌）的高通量测序技术，已成为解析微生物群落结构、多样性及功能的“黄金标准”。本文将深入探讨基于这些技术的微生物群落多样性检测项目的核心内容。

一、技术基石：16S与ITS测序原理

靶标选择：
- 16S rRNA基因： 存在于所有细菌和古菌基因组中，具有高度保守区域（用于设计通用引物）和可变区域（用于区分不同物种）。通常选择1-4个高变区（如V1-V2, V3-V4, V4-V5, V4等）进行测序。
- ITS区域： 位于真菌核糖体基因簇中，位于18S rRNA、5.8S rRNA和28S rRNA基因之间。包括ITS1和ITS2两个非编码间隔区，其序列变异程度高于18S基因，使其成为区分真菌物种（尤其是属和种水平） 的理想靶标。
核心流程：
- 样本采集与保存： 根据样本类型（粪便、土壤、水、拭子等）采用特定方法采集，并立即使用保护剂（如RNAlater）或低温（-80°C）保存，防止DNA降解和群落变化。
- DNA提取： 使用物理（如珠磨）、化学（如裂解液）和酶法相结合的方法，高效、无偏好性地裂解不同微生物细胞壁/膜，提取总基因组DNA。提取方法的优化至关重要，直接影响结果的代表性和准确性。
- PCR扩增： 使用针对目标区域（16S V3-V4, ITS1/ITS2等）的通用引物进行PCR扩增。引物设计需兼顾覆盖广度（尽可能扩增目标类群）和特异性（避免非特异性扩增）。同时添加测序接头和样本特异性Barcode（索引序列），以便后续混合测序和样本拆分。
- 文库构建与质检： 纯化PCR产物，测定浓度，并进行片段大小分布检测（如Agilent Bioanalyzer）。合格的文库按等摩尔浓度混合。
- 高通量测序： 主要在Illumina NovaSeq、MiSeq或HiSeq平台上进行双末端（Paired-End）测序（如2x250 bp或2x300 bp），产生海量短序列读长（Reads）。
- 生物信息学分析： 这是将原始数据转化为生物学洞见的关键步骤，包括：
  - 数据质控与过滤： 去除低质量序列、接头序列、引物序列。
  - 序列拼接（Pair-End Reads）： 将成对Reads拼接成更长的代表原始靶标区域的序列（Tags）。
  - 去噪与聚类/去嵌合：
    - 传统方法： 按预设相似度阈值（通常97%）将Tags聚类成操作分类单元（OTU），代表一个假定物种。
    - 现代方法： 使用如DADA2、Deblur、UNOISE3等算法，校正测序错误，生成扩增子序列变体（ASV），提供更高分辨率和可重复性。
  - 物种注释： 将OTU/ASV代表序列与参考数据库（如Silva、Greengenes、UNITE）进行比对，赋予其分类学信息（门、纲、目、科、属、种）。
  - 多样性分析：
    - α多样性： 衡量单个样本内的物种丰富度（如Observed OTUs/ASVs, Chao1）和均匀度（如Shannon, Simpson）。揭示样本内部多样性水平。
    - β多样性： 衡量不同样本间微生物群落组成的差异。常用方法包括主坐标分析（PCoA）、非度量多维尺度分析（NMDS）（基于Bray-Curtis, Unifrac等距离矩阵），以及主成分分析（PCA）。
  - 群落结构分析： 绘制不同分类等级（门、属等）的物种组成柱状图、热图等，直观展示群落构成。
  - 差异分析： 比较不同分组（如健康vs疾病、处理vs对照）样本间物种丰度或群落结构的显著差异（如LEfSe, DESeq2, ANOSIM, PERMANOVA）。
  - 功能预测（可选）： 基于16S数据，利用PICRUSt2、Tax4Fun等工具预测潜在的微生物群落功能通路。注意：此为预测，非直接测量。

二、核心检测项目：从数据到洞察

一个完整的微生物多样性检测项目报告，通常包含以下核心分析结果：

数据产出统计：
- 原始数据量、有效数据量、平均测序深度（每个样本的序列数）。
- 质控后各样本的Tags/Reads数量统计。
- OTU/ASV总数及在各样本中的分布。
物种注释结果：
- 注释到各分类等级（门、纲、目、科、属、种）的物种数量及列表。
- 物种组成谱： 以柱状图、饼图等形式展示各样本在门、属等关键水平的优势菌群构成。
- 核心微生物群： 在所有或大多数样本中稳定存在的微生物类群。
Alpha多样性分析：
- 计算并展示各样本的多种α多样性指数（Observed OTUs/ASVs, Chao1, Shannon, Simpson, Pielou’s Evenness等）。
- 组间比较： 通过箱线图、小提琴图等可视化展示不同分组（如不同处理、不同时间点、不同健康状况）的α多样性差异，并辅以统计检验（如t-test, ANOVA, Kruskal-Wallis）结果，判断差异显著性。
Beta多样性分析：
- 计算样本间距离/相似性矩阵（Bray-Curtis, Weighted/Unweighted Unifrac等）。
- 群落结构差异可视化： 通过PCoA、NMDS等降维图展示样本聚类情况。不同分组样本用不同颜色/形状区分。
- 组间差异显著性检验： 使用ANOSIM、PERMANOVA、MRPP等统计方法，量化不同分组间群落结构的整体差异是否显著。
物种差异分析：
- 标志物物种筛选： 利用LEfSe（Linear Discriminant Analysis Effect Size）等方法，找出在特定分组中显著富集、具有显著判别能力的生物标志物（从门到属/种水平）。
- 差异物种列表： 提供在组间丰度存在显著差异的物种列表（如基于DESeq2、edgeR等），包括差异倍数（Fold Change）和p值/FDR值。
样品间关系分析（可选）：
- 基于群落相似性的层次聚类树（Heatmap with Clustering）。
- 网络分析（Co-occurrence Network），揭示微生物物种间的潜在共现或互斥关系。

三、项目设计要点与质量控制

明确研究目标： 是探索性描述？还是比较组间差异？寻找生物标志物？目标决定了样本量、测序深度、分析策略。
严谨的实验设计：
- 样本量与重复： 保证足够的生物学重复（通常每组至少3-5个独立样本）以捕捉个体/环境变异，满足统计学要求。
- 对照组设置： 设置合适的对照（如健康对照、未处理对照）是进行比较研究的基础。
- 混杂因素控制： 记录并尽量控制可能影响结果的变量（如年龄、性别、饮食、采样时间、地理位置）。
严格的样本处理：
- 标准化操作程序（SOP）： 确保从采样到DNA提取的可重复性。
- 防污染措施： 使用无DNA酶耗材，设置提取阴性对照（不含样本的提取试剂）、PCR阴性对照（以水为模板）和测序阴性对照（空文库），监控并排除污染。
测序深度选择： 足够的测序深度（通常每个样本有效Tags > 30,000 - 50,000）是检测低丰度物种的关键。需根据样本复杂度预估。
生物信息学流程标准化与透明化： 使用主流、稳定的分析流程和参数，并详细记录在报告中，确保结果可重复。
数据库选择： 选择合适且更新及时的参考数据库（如Silva 138.1 for 16S, UNITE 9.0 for ITS）进行物种注释。

四、应用场景广泛

医学与健康： 肠道菌群与肥胖、糖尿病、IBD、自闭症、癌症等的关联研究；呼吸道、皮肤、生殖道等微生态研究；个性化营养与益生菌干预评估。
环境科学： 土壤健康评估与修复效果监测；水体（河流、湖泊、海洋）污染指示与生态评价；污水处理厂工艺优化与功能菌群解析；生物地球化学循环研究。
农业与食品： 根际/叶际微生物组与作物健康、抗病性、产量的关系；发酵食品（酸奶、泡菜、酒类）风味形成与工艺优化；饲料添加剂对畜禽肠道健康的影响；生物农药/肥料研发。
工业生物技术： 生物能源生产（如厌氧消化产沼气）中的功能菌群解析与过程优化；工业酶产生菌筛选；生物浸矿微生物群落研究。

五、局限性与未来方向

分辨率限制： 16S/ITS测序通常在属或种水平提供较好分辨率，精确到种或菌株水平有时困难。预测功能不如宏基因组直接。
“死菌”干扰： DNA测序无法区分活菌与死菌DNA。
引物偏好性： 通用引物无法100%覆盖所有微生物，存在扩增偏好。
数据库局限性： 仍有大量环境微生物未被培养和测序，注释可能不完整或不准确。
未来趋势： 与宏基因组、宏转录组、代谢组等多组学联合分析；长读长测序（如PacBio, Oxford Nanopore）提高分辨率；单细胞微生物组学；更先进的生物信息学算法和人工智能应用。

结语

16S/ITS高通量测序作为解析微生物群落多样性的强大工具，通过严谨的项目设计、标准化的实验流程和深入的数据分析，能够为我们揭示微观世界中复杂而精妙的生命网络。其提供的群落结构、多样性和关键物种信息，在基础研究、医学诊断、环境保护、工农业生产等诸多领域都具有不可估量的价值。随着技术的不断进步和多组学整合的深入，我们对微生物世界的认知必将更加全面和深刻，从而更好地服务于人类社会的可持续发展。