CUT&Tag

CUT&Tag 完整技术解析：聚焦核心检测项目

CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）作为表观遗传学研究的革命性技术，以其高信噪比、低细胞起始量、操作相对简便等优势，正迅速取代传统ChIP-seq。本文将系统阐述CUT&Tag的核心原理、标准流程，并重点剖析其关键的检测项目与质控要点，为您的实验成功提供详细指导。

一、 CUT&Tag技术原理与核心流程概览

1. 核心思想： 在细胞核内原位完成目标蛋白（如转录因子、组蛋白修饰）的抗体结合，并通过融合蛋白（Protein A/G-Tn5转座酶）引导Tn5转座酶在抗体结合位点附近切割基因组DNA并同时加上测序接头。最终释放的DNA片段即携带目标蛋白结合位点的信息。
2. 核心优势：
   • 高灵敏度与信噪比： 原位操作减少了非特异背景，尤其适合稀有细胞或低丰度靶标。
   • 低细胞起始量： 可低至单细胞水平（需优化），常规实验只需50, 000 - 500, 000个细胞。
   • 操作简便、快速： 相比ChIP-seq省去了交联、超声破碎、免疫沉淀等繁琐步骤。
   • 高分辨率： 定位更精确。
3. 标准流程简述：
   1. 细胞准备与透化： 收集细胞，使用温和透化剂（如Digitonin）处理，使抗体和融合蛋白能进入细胞核。
   2. 一抗孵育： 加入特异性一抗识别目标蛋白（如H3K27ac抗体），孵育结合。
   3. 二抗孵育 (可选)： 若一抗宿主非兔/羊，需加入对应的Protein A/G二抗桥接。
   4. Protein A/G-Tn5融合蛋白孵育： 加入融合蛋白（如pA-Tn5或pG-Tn5），其Protein A/G部分特异结合一抗/二抗上的Fc片段，将Tn5转座酶精准“锚定”在目标蛋白附近。
   5. 激活与Tagmentation： 加入激活缓冲液（含Mg²⁺），激活Tn5酶活性。激活的Tn5在抗体结合位点附近的开放染色质区域同时切割DNA并在切割端加上测序接头。此步骤在细胞核内完成。
   6. DNA片段释放与纯化： 裂解细胞，使用蛋白酶K消化蛋白（包括抗体和融合蛋白），释放带有接头的DNA片段。纯化DNA文库。
   7. PCR扩增与文库质检： 使用带Index的引物对文库进行有限循环数的PCR扩增，添加测序引物序列和样本特异性barcode。对扩增产物进行片段大小分布和浓度检测。
   8. 高通量测序： 通常在Illumina平台上进行双端测序（PE）。

二、 CUT&Tag 核心检测项目详解（实验成功的关键）

CUT&Tag实验的成功高度依赖于对关键实验环节的严格质控。以下是贯穿整个流程的核心检测项目：

1. 细胞活性与状态检测：

   • 目的： 确保实验起始材料健康，避免死细胞或状态异常细胞引入背景噪音。
   • 检测方法：
     • 台盼蓝染色： 计数活细胞比例，保证活率 >80%（冻存细胞解冻后尤其重要）。
     • 显微镜观察： 评估细胞形态是否正常，聚集成团情况。
     • (可选) 流式细胞术： 分析特定表面标志物或活性染料（如PI）确认细胞活力和类型。

2. 透化效率检测：

   • 目的： 透化是抗体和融合蛋白进入细胞核的关键。不足则信号弱，过度则细胞核结构破坏，背景增高。
   • 检测方法：
     • 抗体染色法： 使用靶向核内广泛抗原（如组蛋白H3）的抗体，与您的实验细胞平行进行透化处理，然后进行免疫荧光染色。通过荧光显微镜或流式细胞术检测抗体进入细胞核的效率。高效透化应显示明亮的核内信号。
     • 观察法： 经验丰富的操作者可在显微镜下根据细胞形态（轻微膨胀）判断，但不如抗体法客观准确。

3. 抗体特异性与效价检测（重中之重！）：

   • 目的： 抗体是CUT&Tag成功的基石。非特异或低效价抗体会导致高背景或信号微弱甚至失败。
   • 检测方法：
     • 文献调研： 优先选择已在高质量CUT&Tag或ChIP-seq文献中成功验证的抗体（尤其同物种）。查看供应商提供的ChIP或CUT&Tag验证数据。
     • 免疫印迹 (Western Blot)： 验证抗体在目标物种细胞裂解液中识别单一正确大小的条带。
     • 免疫荧光 (IF)： 在目标细胞上观察预期的亚细胞定位模式（如H3K27ac应富集在活跃启动子/增强子区域，核内点状或弥漫信号）。
     • 使用对照样本： 阳性对照（已知表达靶蛋白的细胞）应强阳性；阴性对照（敲除细胞、同型IgG、无抗体）应信号极低或无信号。这是最直接、最重要的质控。
     • Titration测试： 对新抗体或重要实验，需测试不同抗体浓度（如0.5-5 μg/百万细胞）对信噪比的影响，找到最优浓度。

4. 融合蛋白 (pA/G-Tn5) 活性检测：

   • 目的： 确保购买的或自制的融合蛋白具有有效的转座酶活性。
   • 检测方法：
     • 供应商质检报告： 购买商品化蛋白时，查看供应商提供的活性检测数据（如体外tagmentation效率）。
     • 阳性对照实验： 在正式实验中设置阳性对照（如抗H3K4me3，其在活性启动子富集，信号强且广谱）。成功的阳性对照是融合蛋白整体有效性的有力证明。
     • (高级) 体外活性测试： 可用纯化的基因组DNA与融合蛋白在体外进行tagmentation反应，检测文库产量和片段分布。

5. Tagmentation效率检测：

   • 目的： 评估激活步骤后，Tn5在细胞核内切割和加接头的整体效果。效率过低影响文库产量和信号。
   • 检测方法：
     • 文库片段大小分析 (关键指标)： 在DNA纯化后、PCR扩增前，使用高灵敏度DNA分析仪（如Agilent Bioanalyzer/Tapestation或Fragment Analyzer）检测纯化的DNA片段大小分布。成功的CUT&Tag应在100-1000 bp范围内呈现典型的“梯形”分布，主峰集中在100-300 bp左右。出现大片段拖尾或单一主峰可能提示tagmentation不足或过度消化。这是实验中期最重要的质控点之一。
     • qPCR (可选)： 针对已知的强阳性位点设计引物，与阴性区域引物比较，可在早期评估富集效率（需优化）。

6. PCR扩增文库的质控：

   • 目的： 确保扩增后的文库质量合格，适合上机测序。
   • 检测方法：
     • 片段大小分布： 再次使用Bioanalyzer/Tapestation/Fragment Analyzer检测PCR产物的片段大小分布。理想结果应与tagmentation后的分布相似（梯形），但整体峰位置可能因接头大小略向右移（如增加~100-150 bp）。应避免出现引物二聚体峰（~100 bp以下）或过大片段峰。
     • 浓度测定： 使用荧光定量法（如Qubit dsDNA HS Assay）准确测定文库浓度。避免使用基于吸光度（Nanodrop）的方法，因其易受杂质干扰。
     • 摩尔浓度计算： 结合片段平均大小和浓度，计算文库的摩尔浓度（nM），用于精确混合不同样本进行pooling和测序。

7. 高通量测序数据的质控 (生信分析)：

   • 目的： 评估测序数据的整体质量、文库复杂度、富集效率和特异性。这是最终确认实验成功与否的关键。
   • 核心检测指标：
     • 测序质量 (Q score)： FastQC等工具评估，确保碱基质量达标（Q30 > 80%）。
     • 比对率： 高质量数据应大部分（>70-80%）能唯一比对到参考基因组。
     • 文库复杂度： 评估测序深度是否足够、是否过度PCR重复。常用指标包括：
       • 唯一比对数： 去除重复后唯一比对上的reads数。
       • PCR重复率： 重复reads的比例（越低越好，通常<50%）。
       • FRiP值 (关键指标)： Fraction of Reads in Peaks。落在Peak区域的reads占总比对reads的比例。反映了富集效率。一般**>5-10%被认为是可接受的，>20%**是非常好的结果（因靶标和抗体而异，阳性对照应更高）。
     • Peak Calling质量：
       • Peak数量与分布： 应在预期区域（如启动子、增强子）检测到合理数量的Peaks。阳性对照应有数千至上万个Peaks。
       • Peak强度： Peak的富集倍数应显著高于背景。
       • 相关性分析： 生物学重复样本之间（或与已发表数据）的Peak信号应具有高相关性（如Pearson相关系数 > 0.8）。
     • 背景噪音评估：
       • 与阴性对照比较： 使用IgG对照或无抗体对照进行Peak calling，实验样本的Peak应显著富集于对照之上。常用MACS2的callpeak命令结合-c指定对照。
       • Promoter/Enhancer富集： 对于组蛋白修饰，Peaks应富集在相应功能元件上（如H3K4me3在TSS，H3K27ac在活性增强子）。
       • Motif分析： 对于转录因子，Peaks下应富集其已知的DNA结合Motif。

三、 实验设计建议

1. 设置严谨的对照： 必不可少！
   • 阳性对照： 推荐使用抗H3K4me3或H3K27ac等强信号、广谱的组蛋白修饰抗体。用于验证整个实验流程（从透化到测序）是否成功。
   • 阴性对照：
     • IgG对照： 使用与一抗同物种、同亚型的非特异性IgG。最常用，强烈推荐。
     • 无抗体对照 (No-Ab Control)： 省略一抗步骤，仅进行后续融合蛋白和tagmentation操作。用于检测融合蛋白的非特异结合和背景切割。
     • (理想) 敲除/敲低细胞对照： 如果条件允许，使用靶蛋白缺失的细胞系作为生物学阴性对照，最具说服力。
2. 生物学重复： 通常建议至少设置2-3个独立的生物学重复（不同批次的细胞培养和实验处理），以评估实验的可重复性和进行统计学分析。
3. 测序深度： 取决于靶标和目的：
   • 组蛋白修饰：通常10-20 million unique mapped reads。
   • 转录因子：可能需要更高深度（20-50 million unique mapped reads），因其Peaks通常更窄、信号相对较弱。
   • 探索性研究或稀有细胞类型：可能需要更深深度。

四、 常见问题与排查

• 信号弱或无信号：
  • 检查细胞活力和透化效率（抗体是否能进入核内）。
  • 确认抗体特异性、效价和用量是否足够（做Titration，检查阳性对照）。
  • 检查融合蛋白活性（阳性对照是否成功？）。
  • 检查Tagmentation激活步骤（Mg²⁺浓度、温度、时间）。
  • 检查PCR扩增循环数是否过少。
• 背景噪音高：
  • 检查阴性对照（IgG, No-Ab）的FRiP值。高背景通常意味着它们也有信号。
  • 优化透化条件（避免过度透化）。
  • 优化一抗和二抗浓度（过高易非特异）。
  • 确保充分清洗步骤（尤其是一抗、二抗、融合蛋白孵育后）。
  • 检查融合蛋白是否有非特异吸附（尝试不同批次或供应商）。
  • 检查细胞是否死亡过多或状态不佳。
• 文库片段大小异常：
  • 大片段拖尾：Tagmentation可能不足（检查激活条件，融合蛋白活性/用量）。
  • 单一小片段峰（~200 bp）：可能蛋白酶K消化过度或超声打断步骤被错误加入（CUT&Tag无需超声！）。
  • 引物二聚体峰：优化PCR条件（减少循环数，优化引物浓度），增加片段筛选步骤（如AMPure beads大小筛选）。

五、 总结

CUT&Tag是一项强大且高效的表观基因组图谱绘制技术。其成功的关键在于对核心检测项目的深刻理解和严格执行。从细胞状态、透化效率、抗体验证、融合蛋白活性，到Tagmentation效率、文库质量，再到最终的数据分析质控（尤其是FRiP值、对照比较），每一步的精心检测和优化都是获得高质量、可信结果的基础。将文中强调的检测项目纳入您的标准操作流程，并结合严谨的实验设计（对照、重复），将极大提升您CUT&Tag实验的成功率和数据可靠性。

实验设计建议速查表：

掌握这些核心检测要点，您就能更有把握地利用CUT&Tag技术探索染色质调控的奥秘！