90天经口毒性试验

90天经口毒性试验：全面评估化学物质亚慢性毒性的基石

1. 定义与目的

90天经口毒性试验是一种标准化的亚慢性毒性试验方法。其核心目的是评估实验动物（通常为大鼠或小鼠）在相对较长时间内（连续90天）重复经口接触受试化学物质后，可能产生的有害健康效应。该试验是化学品、药品、农药、食品添加剂及工业原料安全性评价的关键环节，主要目标包括：

• 识别靶器官/系统： 确定受试物反复暴露后主要损害的器官或生理系统。
• 揭示毒性效应谱： 观察并描述可能出现的临床体征、体重变化、食物消耗改变、血液学、临床生化学、尿液指标改变以及组织病理学损伤等。
• 建立剂量-反应关系： 明确毒性效应的产生与不同暴露剂量/浓度之间的联系。
• 确定关键毒性参数：
  • NOAEL (No Observed Adverse Effect Level - 未观察到有害作用剂量水平)： 在试验条件下，未观察到任何可归因于受试物的有害生物学或病理学改变的最高剂量。
  • LOAEL (Lowest Observed Adverse Effect Level - 最低观察到有害作用剂量水平)： 在试验条件下，明确观察到可归因于受试物的有害生物学或病理学改变的最低剂量。
• 为慢性毒性研究和风险评估提供依据： 为更长期的慢性毒性试验的设计（如剂量选择、观察重点）以及最终的人类健康风险评估提供关键数据基础。

2. 实验设计

• 实验动物：
  • 物种： 首选健康、年轻的成年啮齿类动物，通常为大鼠（Sprague-Dawley, Wistar等品系）或小鼠。选择依据受试物预期用途、代谢相似性及历史数据可获得性。
  • 数量和性别： 每个剂量组通常包括同等数量的雄性和雌性动物（如每组每性别10只）。设置足够数量以满足统计学分析要求。
  • 年龄与体重： 使用刚断奶或体重相近的年轻成年动物（如大鼠约6-8周龄）。试验开始时组内动物体重差异应尽可能小。
• 分组与剂量设计：
  • 对照组： 必需设置溶剂/载体对照组（接受与给药组相同体积和频率的溶剂或赋形剂）。根据研究目的或机构常规，可能增设空白对照组（仅接受基础饲料/饮水，不含溶剂）。
  • 给药组： 至少设置三个剂量组。
    • 高剂量组： 应能诱发明显的毒性效应（如体重增长抑制<10%，或出现特定靶器官毒性），但不应引起动物过早死亡（死亡率≤10%）或严重痛苦而需人道处死。
    • 中剂量组： 应能观察到轻微的毒性效应或生理变化，位于高剂量组和低剂量组之间，以建立剂量-反应关系。
    • 低剂量组： 预期接近或低于NOAEL，旨在确定无明显有害效应的暴露水平。
  • 剂量选择依据： 通常基于急性毒性数据（如LD50）、短期重复剂量试验（如28天试验）结果、预期的用途暴露水平或文献资料。
• 给药途径与方式：
  • 途径： 经口给药是核心。
  • 常用方法：
    • 灌胃法： 使用胃管或灌胃针将受试物溶液或混悬液直接注入动物胃内。这是最精确控制剂量的方法，通常为首选。需注意操作熟练度以减少机械损伤风险。
    • 掺食法： 将受试物均匀混合到动物饲料中。更接近部分人类暴露场景（如食品污染物），但剂量精确性相对较低（依赖摄食量），且适口性差可能影响进食量。
    • 饮水法： 将受试物溶解或混悬于饮用水中。适用于水溶性好、性质稳定的物质。剂量精确性依赖于饮水量，可能受昼夜节律影响。
  • 给药频率： 通常为每日一次（每周7天），或根据研究方案每周给药5-7天。
  • 给药体积： 灌胃给药体积通常不超过10 ml/kg体重（大鼠）或20 ml/kg体重（小鼠），并需考虑溶剂或赋形剂本身的潜在影响。
• 试验周期： 严格连续给药90天（约13周）。
• 饲养管理：
  • 环境： 符合标准的实验动物设施（温度、湿度、光照周期可控，洁净度达标）。
  • 笼具： 适宜大小，通常同性别群养（特殊情况除外），提供充足垫料。
  • 饲料与饮水： 提供符合标准的商品化实验动物饲料和自由饮用的清洁饮水。若采用掺食法，需确保受试物在饲料中混合均匀且稳定。
• 伦理与动物福利： 试验方案必须经过机构动物管理与使用委员会的严格审查和批准。严格遵守动物福利伦理原则（如3R原则：替代、减少、优化），尽量减少动物痛苦和不适。设置明确的人道终点标准，并对达到终点的动物及时实施安乐死。

3. 观察与检测指标

• 日常临床观察 (Daily Clinical Observations):
  • 频率： 通常每日至少一次（给药前或给药后特定时间），濒死或出现病症动物需增加观察频次。
  • 内容： 监测动物的一般状况、行为活动、神经体征（如震颤、抽搐、麻痹）、呼吸状态、被毛、眼部、体表异常、分泌物、排泄物性状等。详细记录任何异常表现的发生时间、持续时间、严重程度等。
• 体重与摄食量 (Body Weight and Food Consumption):
  • 体重： 每周至少称重两次（通常给药前），个体称重并记录。体重增长抑制是反映系统毒性的敏感指标。
  • 摄食量： 每周至少测量一次（通常计算每周总摄食量/组或/笼）。掺食法时需精确计算每日/每周饲料消耗量以折算实际摄入剂量；灌胃法下摄食量变化也是重要的毒性效应指标。
• 眼科检查 (Ophthalmological Examination):
  • 时间： 建议在试验开始前（作为基线）和试验结束前（或必要时在中途）进行。
  • 方法： 使用专业检眼镜等设备。
• 血液学检查 (Hematology):
  • 时间点： 通常在试验结束前（如第88或89天）和/或试验中期（如第45天）进行采样。
  • 样本： 抗凝全血（常为EDTA抗凝）。
  • 指标： 红细胞计数、血红蛋白、红细胞压积、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白量、平均红细胞血红蛋白浓度、网织红细胞计数、白细胞计数及分类计数（中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞）、血小板计数、凝血时间（如PTT， APTT）等。
• 临床生化检查 (Clinical Chemistry):
  • 时间点： 同血液学检查。
  • 样本： 血清或血浆（常为肝素抗凝）。
  • 指标：
    • 肝功能： 丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转移酶、总胆红素、总蛋白、白蛋白、球蛋白、白球比等。
    • 肾功能： 尿素氮、肌酐、血糖（反映肾小管功能）。
    • 电解质与酸碱平衡： 钠、钾、氯、钙、磷等。
    • 脂代谢： 总胆固醇、甘油三酯。
    • 糖代谢： 血糖（空腹）。
    • 其他： 胆碱酯酶活性（针对特定物质）。
• 尿液分析 (Urinalysis):
  • 时间点： 通常在试验结束前进行（如给药期最后几天）。
  • 样本： 收集特定时间段（如16-24小时）的尿液，可使用代谢笼。
  • 指标： 外观、体积、比重、pH值、尿蛋白、尿糖、尿胆红素、尿胆原、酮体、潜血、尿沉淀物镜检（细胞、管型、结晶）等。
• 大体解剖 (Gross Necropsy):
  • 时间： 所有动物在试验结束时或在试验期间因人道原因处死后立即进行。
  • 内容： 对所有动物进行系统的肉眼检查。记录所有体表、体腔、脏器的大小、形状、颜色、质地、积液、肿块、病变等异常情况。特别注意在临床观察、血液生化等指标提示异常的器官系统。
• 脏器称重 (Organ Weight):
  • 器官： 通常称量绝对重量，并计算相对重量（器官重/体重×100%或器官重/脑重×100%）。
  • 必备器官： 脑、肝脏、肾脏（通常两侧分开称）、肾上腺（两侧分开称）、睾丸（两侧）、附睾、卵巢、子宫、心脏、肺脏、脾脏、胸腺。
  • 其他器官： 根据受试物性质、前期研究结果或大体解剖发现，可能增加甲状腺、前列腺、垂体、肉眼异常器官等。
• 组织病理学检查 (Histopathological Examination):
  • 范围：
    • 高剂量组和对照组： 所有保存的器官组织都必须进行全面的显微镜检查。
    • 中、低剂量组： 至少检查所有肉眼可见病变的组织，以及与高剂量组出现病变相关的组织、靶器官（如已知）或根据其他指标（如血液生化异常、脏器重量改变）提示可能存在病变的组织。
  • 固定与制片： 组织样本通常固定在10%中性福尔马林缓冲液中，经脱水、透明、石蜡包埋、切片、染色（常用苏木精-伊红染色）制成病理切片。
  • 阅片： 由经验丰富的兽医病理学家在不知晓分组信息（盲法）的条件下进行显微镜检查。
  • 记录： 详细描述病变的性质、分布、严重程度（分级）等。这是确定靶器官毒性和损伤性质的最关键证据。

4. 数据收集、分析与报告

• 数据收集： 所有观察结果（临床、体重、摄食、眼科）、检测数据（血液学、生化、尿液）和病理发现都必须及时、准确、完整地记录在原始记录中。
• 统计分析：
  • 对计量资料（体重、摄食量、脏器重量、血液生化、尿液定量指标等），通常采用适当的参数检验（如t检验、ANOVA）或非参数检验进行组间比较（各给药组与溶剂对照组比较）。
  • 对计数资料或分级资料（临床体征发生率、病理病变发生率及严重程度分级），通常采用卡方检验、Fisher精确检验或秩和检验等方法分析组间差异。
  • 统计显著性通常设定为 p<0.05。 但需结合生物学意义进行综合判断（如剂量-反应趋势、效应大小）。
• 报告撰写： 最终研究报告应详细包含以下内容：
  • 试验摘要。
  • 引言（试验目的、依据）。
  • 材料与方法（受试物、动物、试验设计、分组剂量、给药、观察检测方法、统计方法）。
  • 结果（按观察指标分类详细陈述，包括表格和图）。
  • 讨论（解释结果，识别靶器官和毒性特征，讨论剂量-反应关系，确定NOAEL/LOAEL，与文献或相关试验结果比较，评估毒理学意义）。
  • 结论（明确陈述主要发现、NOAEL/LOAEL值及关键毒性结论）。

5. 关键价值与应用

90天经口毒性试验填补了急性毒性和慢性（如1-2年）毒性试验之间的数据空白。它所确定的NOAEL/LOAEL是进行风险评估、制定安全限值（如每日允许摄入量、参考剂量）的核心科学依据。该试验提供的详细靶器官毒性信息对于理解化学物质的毒作用机制、指导后续研究（如生殖发育毒性、遗传毒性、慢性毒性）、支持化学品分类标签以及产品安全使用至关重要，是全球化学品、农药、药品、食品添加剂等法规注册不可或缺的必做研究项目。

总结：

90天经口毒性试验通过系统、规范的90天重复给药，结合全面的临床观察、血液体液检测、大体解剖和细致的组织病理学检查，为评估化学物质在亚慢性暴露条件下对哺乳动物的潜在健康危害提供了坚实可靠的科学数据。其结果对于保护人类健康和环境安全具有不可替代的重要意义。试验的设计、执行和报告均需严格遵守国际国内公认的标准化指南和严格的伦理规范。