28天经口毒性试验

28天经口毒性试验：原理、操作与意义

摘要： 28天经口重复剂量毒性试验是评估化学物质、药品及其他产品亚慢性毒性的核心方法之一。该试验通过连续28天经口给予实验动物受试物，系统性地观察可能产生的毒性效应，为产品安全性评价及制定安全接触限值提供关键数据。本文详细阐述该试验的目的、原理、设计实施要点、观察指标及其意义。

一、试验目的与原理

• 核心目的： 评估受试物在重复经口接触条件下（亚慢性暴露）对机体可能产生的毒性作用，确定毒性靶器官、剂量-反应关系及无明显有害作用剂量水平(NOAEL)。
• 科学原理： 模拟人类或动物可能经历的长期低剂量经口暴露场景（如食品添加剂、环境污染物、药品等）。相较于急性毒性试验，该试验能更全面地捕捉因蓄积作用或缓慢发展而产生的器官损伤、生理功能紊乱及潜在的致敏、免疫抑制等效应。

二、试验设计与实施

1. 试验动物：

   • 物种选择： 首选健康、成年大鼠（如SD、Wistar品系），其对化学物质反应的数据丰富，且经济实用。根据特殊需要，也可选用小鼠、犬或其他非啮齿类动物。
   • 性别与数量： 通常雌、雄动物各半。每组动物数量需满足统计学要求，一般啮齿类动物每组通常不少于10只（雌雄各半）。设置足够的组别以保证能观察到剂量-反应关系。
   • 动物管理： 实验前需进行检疫适应（通常至少5天）。动物饲养于符合标准的SPF或清洁级环境中，自由饮水，饲喂标准实验室饲料，环境条件（温度、湿度、光照周期）严格调控。

2. 剂量分组：

   • 组别设置： 通常设至少三个剂量组和一个溶剂/赋形剂对照组（阴性对照）。剂量组的设置应预期能产生毒性效应（高剂量组）、观察到最低毒性效应（中剂量组）和不产生明显毒性效应（低剂量组/NOAEL组）。
   • 剂量设计依据： 参考受试物的急性毒性数据（如LD50）、结构类似物数据、预期人接触水平及预试验结果。剂量间距通常采用几何级数（如2、4、8倍）。必要时可增设阳性对照组（仅用于验证特定方法的敏感性）。
   • 对照组： 阴性对照组仅给予与受试物溶解或混悬所用相同体积的溶剂或赋形剂，是评价受试物毒性的基准。

3. 给药途径与方式：

   • 途径： 经口（Oral）。这是该试验的核心特征。
   • 方式：
     • 灌胃（Gavage）： 最常用，使用灌胃针将受试物溶液/混悬液直接送入胃内。优点是剂量准确，避免适口性问题。需注意操作手法，防止误入气管或损伤食道。
     • 掺饲法（Dietary Admixture）： 将受试物均匀混合于饲料中供动物自由采食。适用于适口性好、性质稳定的受试物，更接近自然暴露状态。需精确计算饲料消耗量和实际摄入剂量。
     • 饮水法（Drinking Water）： 将受试物溶解于饮水中。适用于水溶性好、性质稳定的物质。同样需监测饮水量以计算实际摄入量。
   • 给药体积： 灌胃给药体积通常大鼠不超过10 ml/kg体重，小鼠不超过20 ml/kg体重。
   • 给药频率与周期： 每天一次（通常固定时间点），连续给药28天。周末通常不间断。

4. 观察指标：

   • 一般临床观察：
     • 每日至少两次（早晚）： 密切观察动物的外观（被毛、皮肤、眼、鼻、口）、行为（活动、反应性）、自主神经活动（瞳孔、呼吸、分泌）、神经症状（震颤、抽搐、麻痹）及粪便性状等。
     • 详尽记录： 任何异常表现的发生时间、严重程度、持续时间、转归情况。
   • 体重与摄食（饮）量：
     • 体重： 给药前称重分组，至少每周称量记录一次（建议2-3次/周）。体重增长抑制是反映全身毒性的敏感指标。
     • 摄食量： 至少每周测量一次（建议2-3次/周）。计算食物利用率（体重增长/摄食量）。掺饲法需精确计算每日摄食量以确定实际受试物摄入剂量。饮水法需测量饮水量。
   • 血液学检查（给药结束前/解剖时）：
     • 指标： 红细胞计数(RBC)、血红蛋白(Hb)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞容积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、白细胞计数(WBC)及分类计数、血小板计数(PLT)、凝血时间等。
     • 目的： 评价受试物对造血系统的影响（如贫血、白血病、凝血功能障碍）。
   • 血液生化学检查（给药结束前/解剖时）：
     • 指标：
       • 肝功能： 丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、总胆红素(TBIL)等。
       • 肾功能： 尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、血糖(GLU)等。
       • 能量代谢/电解质： 总胆固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)、钠(Na⁺)、钾(K⁺)、氯(Cl⁻)、钙(Ca²⁺)、磷(P)等。
     • 目的： 评价受试物对主要器官（肝、肾）功能的损害及对物质代谢和电解质平衡的影响。
   • 尿液分析（给药结束前/解剖前）：
     • 指标： 外观、pH值、比重、尿蛋白、尿糖、尿潜血、尿胆原、酮体、沉渣镜检（细胞、管型、结晶）等。
     • 目的： 辅助评价肾功能、泌尿系统损伤及糖尿病等。
   • 大体解剖（试验结束时）：
     • 操作： 所有存活动物在末次给药后24小时内麻醉处死，进行系统的大体解剖检查。
     • 检查内容： 观察体表、体腔（胸腔、腹腔、颅腔）及各器官（心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、甲状腺/甲状旁腺、睾丸、附睾、子宫、卵巢、脑、胰腺、胃、肠、淋巴结、膀胱、视神经等）的形态、颜色、质地、有无充血、出血、水肿、萎缩、肥大、增生、结节、肿块、粘连等异常。
   • 脏器称重与脏器系数计算：
     • 必称器官： 脑、心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、睾丸、附睾、子宫、卵巢、胸腺、甲状腺（通常与甲状旁腺一起）。
     • 脏器系数： （器官重量 / 动物体重）x 100%。该指标能校正个体体重差异，更客观地反映器官的相对重量变化（如肥大、萎缩）。
   • 组织病理学检查：
     • 范围： 对所有大体解剖发现异常的器官组织，以及所有高剂量组和对照组动物的所有主要器官（通常包括上述所有称重器官及代表性淋巴结、胰腺、膀胱、胃、小肠、大肠、垂体、坐骨神经、骨髓、脊髓、视神经等）进行取材、固定、脱水、包埋、切片、染色（常用HE染色）。
     • 目的： 金标准。在显微镜下观察组织细胞的形态学改变，明确损伤的性质（如变性、坏死、炎症、增生、肿瘤）、程度、部位及范围，精确定位靶器官和组织。中、低剂量组动物通常检查高剂量组发现的靶器官及肉眼可见的病变组织。

三、结果分析与评价

1. 数据处理： 对定量数据（体重、摄食量、血液学、生化学、脏器重量/系数）进行统计学分析（如t检验、方差分析ANOVA），比较各剂量组与阴性对照组的差异是否具有统计学显著性。
2. 剂量-反应关系： 分析毒性效应的严重程度和发生率是否随剂量增加而升高。
3. 毒性判定：
   • 确定出现的异常变化是否由受试物引起（需排除操作、环境、自发性疾病等因素）。
   • 确定毒性效应的性质（可逆/不可逆）和靶器官/组织。
   • 确定观察到有害作用的最低剂量水平（Lowest Observed Adverse Effect Level， LOAEL）。
   • 确定未观察到有害作用的剂量水平（No Observed Adverse Effect Level， NOAEL）。这是安全性评价的关键依据。
4. 试验结论： 综合所有观察指标的结果，对受试物在28天经口重复暴露条件下的整体毒性特征做出评价。

四、试验的意义与应用

• 安全性评价的核心环节： 为新化学物质、农药、兽药、食品添加剂、化妆品原料、工业化学品等的上市前安全评估提供不可或缺的亚慢性毒性数据。
• 制定安全限值的基础： 获得的NOAEL/LOAEL值是推导每日允许摄入量(ADI)、参考剂量(RfD)、职业接触限值(OELs)等安全限值的关键起点。
• 指导后续研究： 为是否需要进行更长期的慢性毒性或致癌性试验及如何设计这些试验提供依据（如剂量选择、重点观察器官）。
• 初步评估蓄积毒性： 连续给药28天可初步揭示受试物的蓄积毒性潜能。
• 识别潜在危害： 可能发现急性毒性试验未能发现的毒性效应（如缓慢发展的器官损伤、内分泌干扰、免疫毒性等）。

五、试验遵循的规范

28天经口毒性试验的设计与操作通常严格遵循国际公认的标准化指南，例如：

• 经济合作与发展组织(OECD)： 测试指南No. 407 “Repeated Dose 28-day Oral Toxicity Study in Rodents”。
• 中国国家标准化管理委员会(GB)： 相应的国家标准（如GB 15193.13-2015 食品安全国家标准 90天经口毒性试验，其原则也适用于28天试验设计）。
• 美国食品药品监督管理局(FDA)/环境保护局(EPA)： 相关的健康效应测试指南。

结论：

28天经口重复剂量毒性试验是连接急性毒性与长期慢性毒性研究的重要桥梁。其系统、规范的观测体系能够全面揭示受试物在亚慢性经口暴露条件下对机体的毒性作用特征，包括确定靶器官、剂量-反应关系和无明显有害作用剂量（NOAEL），为受试物的初步安全风险评估、安全管理决策以及后续研究的开展提供至关重要的科学依据。该试验严格遵循国际国内标准化指南进行，是化学品及产品安全性评价体系中不可或缺的一环。