体外哺乳类细胞TK基因突变试验

发布时间：2025-06-17 08:05:28 阅读量：1 作者：生物检测中心

体外哺乳类细胞TK基因突变试验：原理、方法与应用

一、引言

遗传毒性是指化学物质或物理因素诱发基因突变、染色体结构或数目改变的能力。评估物质的遗传毒性是预测其潜在致癌性和生殖发育危害的关键环节。体外哺乳类细胞胸苷激酶（TK）基因突变试验是国际公认的标准遗传毒性检测方法之一，主要用于检测化学物质（包括药物、工业化学品、农药、环境污染物等）及物理因素（如辐射）诱导基因突变的能力。该试验因其敏感性高、操作相对简便且能有效检测多种突变类型而被广泛应用。

二、试验原理

TK基因突变试验的核心原理基于细胞对特定核苷类似物的抗性筛选：

  1. TK基因功能与核苷酸代谢： 胸苷激酶（TK）是细胞内核苷酸补救合成途径的关键酶，负责将胸苷磷酸化为胸苷一磷酸（dTMP），这是DNA合成的重要前体。
  2. 选择性毒性物质 - 三氟胸苷： 三氟胸苷（Trifluorothymidine, TFT）是一种胸苷类似物。正常具有TK酶活性的细胞（TK⁺/⁺或TK⁺/⁻杂合子）能够将TFT磷酸化，进而整合入DNA，阻断DNA合成，导致细胞死亡。
  3. 突变体表型 - TFT抗性： 当TK基因发生突变（如点突变、缺失、移码突变、某些染色体畸变等），导致TK酶活性完全丧失（TK⁻/⁻纯合或半合子），该细胞将无法有效磷酸化TFT。因此，突变细胞能在含TFT的培养基中存活并增殖，形成可见的克隆。
  4. 杂合基因型优势： 试验常用的细胞系（如小鼠淋巴瘤L5178Y细胞系）是TK位点杂合子（TK⁺/⁻）。这种杂合状态使得TK基因更易因单一等位基因的失活突变（成为TK⁻/⁻）而产生TFT抗性表型，大大提高了试验检测基因突变的灵敏度。该试验不仅能检测传统的基因点突变，还能检测导致基因失活或丢失的缺失、重组等较大范围的遗传损伤。

三、试验系统

  • 常用细胞系： 小鼠淋巴瘤L5178Y细胞系（TK⁺/⁻）是该试验的金标准细胞系。其优势在于生长迅速、悬浮培养、克隆形成率高、TK位点杂合以及对多种诱变剂敏感。人淋巴母细胞TK6细胞系（TK⁺/⁻）也被使用，因其具有更稳定的基因组和p53功能性，可能提供更接近人的反应信息。
  • 培养基与培养条件： 使用特定配方的完全培养基（如RPMI 1640），添加血清及必要的添加剂（如丙酮酸钠）。细胞通常在37°C、5% CO₂的加湿培养箱中进行悬浮培养。

四、试验方法

试验通常遵循国际标准化组织（如OECD）制定的准则（如OECD Guideline 490），基本流程如下：

  1. 细胞准备与适应： 确保试验所用细胞处于良好的生长状态，无支原体污染。试验前细胞需在无胸苷或低胸苷的培养基中适应一段时间，以降低背景突变频率。
  2. 剂量选择：
    • 根据受试物的溶解性、细胞毒性预试验结果确定合适的剂量范围。
    • 通常设置5-8个剂量组，包括阴性（溶剂）对照和阳性对照。
    • 最高剂量应能引起明显的细胞毒性（如相对悬浮生长（Relative Suspension Growth, RSG）或相对总生长（Relative Total Growth, RTG）降至10-20%），但不导致培养物完全无法生长。
    • 剂量间隔通常采用√2或√10的稀释倍数。
  3. 受试物处理：
    • 处理时间： 通常为3-4小时的短期处理（适用于直接诱变剂或需短时暴露的化合物）。对于需要代谢活化或作用较慢的物质，处理时间可延长至24小时或更久。
    • 代谢活化系统（S9 Mix）： 为了模拟体内代谢过程，部分试验组需添加外源性代谢活化系统（如经特定诱导剂处理的大鼠肝脏微粒体组分S9与辅助因子NADPH等的混合物）。
    • 对照组设置：
      • 阴性对照： 仅含溶剂（如DMSO、水等），用于确定本底突变频率。
      • 阳性对照（无活化）： 使用已知的无需代谢活化的直接诱变剂（如甲基磺酸甲酯MMS, 乙基亚硝基脲ENU）。
      • 阳性对照（有活化）： 使用已知需代谢活化的诱变剂（如环磷酰胺CP）。
  4. 表达期：
    • 处理结束后，洗涤细胞去除受试物。
    • 将细胞重新悬浮于新鲜的不含受试物的完全培养基中。
    • 表达期通常持续2-3天（小鼠淋巴瘤细胞）或更长（如人TK6细胞）。此期间目的：
      • 允许受试物诱导的初始DNA损伤修复或固定为稳定的突变。
      • 稀释消耗细胞内残留的野生型TK酶及其代谢产物。
      • 让突变表型得以充分表达（即细胞分裂足够代数）。
    • 在表达期内，定期计数评估细胞毒性（如相对悬浮生长RSG），并调整细胞密度保持对数生长期。
  5. 突变体选择和克隆形成：
    • 表达期结束后，计数存活细胞。
    • 将细胞按一定密度接种于含TFT（通常为3-5 μg/mL）的选择性培养基中（96孔板法或软琼脂法）。
      • 96孔板法： 将细胞悬浮于含TFT的培养基中，分配到96孔板的各孔中（通常每孔200μL）。理论上，每孔接种的细胞数应保证大多数孔（约80%）无克隆生长（源于0个或1个存活细胞），便于统计突变克隆数（有克隆生长的孔）。
      • 软琼脂法: 将细胞与含TFT的软琼脂培养基混合，铺于培养皿中，直接在培养皿中观察计数克隆。
    • 同时，为评估细胞存活率（克隆形成效率），将一部分细胞接种于不含TFT的培养基中（非选择性培养）。
    • 将接种好的平板培养7-14天（具体时间根据细胞系和克隆生长速度而定）。
  6. 克隆计数与结果计算：
    • 突变频率计算：
      • 计数不含TFT平板上的克隆数（代表接种的有活力、能形成克隆的细胞数）。
      • 计数含TFT平板上形成的突变克隆数。
      • 96孔板法: 突变频率（MF）通常使用泊松分布公式计算：MF = [-ln(P₀)] / N，其中P₀是无克隆孔的分数，N是接种到每孔的平均有效细胞数（根据接种细胞总数和在不含TFT平板的平板效率PE校正：N = (接种细胞总数 × PE) / 孔数）。
      • 软琼脂法: 突变频率（MF）= （突变克隆数 / 接种细胞数） × 克隆形成效率校正因子 = （突变克隆数 / 接种细胞数） × （非选择性平板总克隆数 / 非选择性平板接种细胞数）。
    • 相对存活率计算：
      • 非选择性培养下的平板效率（PE）代表细胞处理后的存活克隆形成能力。相对总生长（RTG）是一个综合细胞毒性的常用指标：RTG (%) = (处理组存活细胞数 / 溶剂对照组存活细胞数) × (处理组PE / 溶剂对照组PE) × 100%。
  7. 数据分析与结果判定：
    • 有效性标准：
      • 阴性对照组自发突变频率在实验室历史对照范围内（通常小鼠淋巴瘤L5178Y细胞约为50-200 × 10⁻⁶）。
      • 阳性对照组突变频率显著高于阴性对照（通常达到背景值的数倍至数十倍）。
      • 受试物最高剂量组的RTG应在10-20%之间，表明达到足够细胞毒性。
      • 剂量组设置得当，包含导致细胞毒性变化的剂量。
    • 阳性结果判定（诱变阳性）： 通常需满足以下条件：
      • 统计学显著性： 至少有一个剂量组的突变频率与阴性对照组相比，差异具有统计学意义（如采用Fisher Exact Test或Chi-Square Test等）。
      • 剂量-反应关系： 突变频率随受试物剂量增加而增加（通常表现出线性或非线性上升趋势）。
      • 生物学意义： 突变频率的增加幅度应超过实验室历史背景值的范围（常设定为2倍或3倍本底值作为临界点），且这种增加具有可重复性。
    • 阴性结果判定（诱变阴性）： 在达到足够细胞毒性的剂量范围内（RTG降至10-20%），所有剂量组的突变频率均未出现统计学显著且具有生物学意义的增加，且无剂量-反应关系。
    • 可疑结果： 结果不明确，例如仅个别离散剂量点出现微小但统计显著的增加，但无剂量-反应关系；或仅在高毒性剂量下出现微小增加。需谨慎解读，可能需要重复试验。

五、应用与优缺点

  • 应用：
    • 化学物质（药物、工业化学品、农药、添加剂等）遗传毒性筛选和评估。
    • 环境污染物遗传毒性检测。
    • 医疗器械浸提液遗传毒性评价。
    • 物理因素（如辐射）遗传毒性研究。
    • 机制研究（如代谢活化/解毒途径）。
  • 优点：
    • 敏感性高： 得益于杂合基因型(TK⁺/⁻)，能有效检测点突变、移码突变、缺失、重组等多种类型的基因突变（尤其是较大范围的缺失突变是其相对独特优势）。
    • 定量性好： 可直接计算突变频率。
    • 检测终点明确： 检测特定基因（TK）的功能丧失突变。
    • 哺乳动物系统： 使用哺乳动物细胞，比细菌系统（如Ames试验）在代谢、DNA修复等方面更接近人体。
    • 标准化程度高： 有完善的国际指南（如OECD 490, ICH S2(R1)），试验程序规范，结果可比性强。
    • 相对快速： 整个试验周期一般在3-4周内（包括表达期）。
  • 缺点：
    • 细胞毒性干扰： 高细胞毒性可能导致细胞生长延迟、选择偏差，影响突变频率的准确评估。
    • 背景突变： 存在本底突变频率，需严格对照。
    • 代谢差异： 即使加入S9混合液，其代谢能力仍与完整肝脏或人体代谢存在差异。
    • 仅体外系统： 缺乏吸收、分布、排泄等整体动物因素。
    • 操作相对复杂： 比Ames试验步骤多、耗时长，技术要求较高（无菌操作、克隆计数等）。
    • 主要检测基因失活： 主要检测导致基因功能丧失（Loss-of-function）的突变。

六、在遗传毒性测试组合中的地位

TK基因突变试验是国际协调委员会（ICH）关于人用药物遗传毒性试验标准组合（ICH S2(R1)）中推荐的两种体外基因突变试验之一（另一种是体外哺乳类细胞微核试验或体外染色体畸变试验）。它作为Ames试验（检测细菌基因突变）的重要补充，因其使用哺乳动物细胞并能检测更广泛的突变类型（尤其是缺失），在评估物质潜在诱导基因突变风险方面扮演着重要角色。阳性结果提示该物质具有诱导哺乳动物细胞基因突变的潜力，需要进一步的风险评估。

七、结论

体外哺乳类细胞TK基因突变试验是一个成熟、灵敏且标准化的体外遗传毒性检测方法。它通过检测受试物诱导TK基因功能丧失突变的能力，能有效识别多种类型的基因突变剂。尽管存在一定的局限性（如代谢差异、细胞毒性干扰），其在化学物质安全评价、药物开发和环境监测等领域仍是不可或缺的重要工具，尤其在检测缺失等大片段突变方面具有独特价值。作为遗传毒性标准测试组合的一部分，其结果对于评估物质的潜在致癌性和遗传危害至关重要。

关键参考文献（示例）：

  • OECD Guideline for the Testing of Chemicals, No. 490: In vitro Mammalian Cell Gene Mutation Tests Using the Thymidine Kinase Gene.
  • ICH Harmonised Guideline S2(R1): Guidance on genotoxicity testing and data interpretation for pharmaceuticals intended for human use.
  • Moore, M. M., et al. (2003). Mouse lymphoma thymidine kinase gene mutation assay: International workshop on genotoxicity test procedures (IWGTP) Workgroup report. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 540(2), 127-140.
  • Clive, D., & Spector, J. F. S. (1975). Laboratory procedure for assessing specific locus mutations at the TK locus in cultured L5178Y mouse lymphoma cells. Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, 31(1), 17-29. (奠基性文献)
  • Liechty, M. C., et al. (1998). The mouse lymphoma assay. Mutation Research/Reviews in Mutation Research, 410(2), 127-140.