哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验

哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验

摘要: 本试验是评估化学物质潜在致突变性的标准体内试验方法，通过检测受试物诱导哺乳动物骨髓细胞染色体结构畸变的能力，为遗传毒性风险评估提供关键数据。

一、 目的与原理 本试验旨在检测受试物能否诱发哺乳动物体内骨髓细胞的染色体结构损伤（染色体畸变）。骨髓是体内细胞分裂活跃的组织，易于获取分裂中期的细胞进行染色体分析。化学物质或其活性代谢产物若具有遗传毒性，可干扰细胞分裂过程（如有丝分裂），导致染色体断裂、重排等结构异常。通过观察骨髓细胞中期染色体，可识别和分析不同类型的染色体畸变，从而判断受试物的致突变潜能。

二、 试验系统

1. 实验动物:
   • 通常选用健康、初成年的啮齿类动物，首选大鼠或小鼠。
   • 试验开始时，动物体重变异应尽可能小（通常不超过平均体重的±20%）。
   • 每个剂量组和对照组需包含足够数量、性别均衡的动物（通常每组至少5只可评价的动物/性别）。必要时可仅使用单一性别（通常雄性），但需有充分理由。
   • 动物应在适宜环境下（温度、湿度、光照周期可控）饲养，自由饮水，使用标准的实验室饲料。
2. 靶细胞: 骨髓有核细胞（主要是正在分裂的成红细胞和前红细胞）。

三、 试验材料与试剂

• 染毒: 受试物（根据性质选择合适的溶剂/赋形剂，如生理盐水、羧甲基纤维素钠溶液、玉米油等），阳性对照物（常用环磷酰胺或丝裂霉素C），溶剂/赋形剂对照（阴性对照）。
• 取材前处理: 秋水仙素溶液或秋水仙胺溶液（用于阻断细胞于分裂中期）。
• 取材: 解剖器械（剪刀、镊子），注射器，针头，玻片。
• 细胞处理:
  • 低渗液：0.075 M 氯化钾溶液。
  • 固定液：甲醇：冰醋酸（3:1），新鲜配制。
• 制片与染色: Giemsa染液或其它合适的染色体染料，磷酸盐缓冲液（pH 6.8）。

四、 试验方法

1. 剂量设计:
   • 通常设立至少3个剂量组和阴性（溶剂/赋形剂）对照组、阳性对照组。
   • 高剂量应能产生一定的毒性征象（如骨髓细胞有丝分裂指数下降，通常建议下降50%以上）或达到最大可行剂量（如限度剂量）。
   • 中、低剂量通常按倍数关系递减（如1/2、1/4高剂量）。
   • 阳性对照组剂量应能产生可重复的、明显高于背景的畸变率。
2. 染毒与取样:
   • 染毒途径：通常采用经口灌胃或腹腔注射，需与预期的人体暴露途径相关。
   • 染毒方案：通常有两种主流方案：
     • 单次染毒： 动物接受一次染毒。在染毒后约12-18小时和36-42小时分别取样（覆盖不同细胞周期）。
     • 多次染毒： 动物在24小时间隔内接受两次染毒（例如第1天和第2天），在第二次染毒后约6小时取样（通常为首选方案，尤其针对S期依赖的诱变剂）。
   • 阳性对照组在取样前约24小时一次染毒（如腹腔注射环磷酰胺）。
   • 阴性对照组与受试物组同期处理。
3. 中期相阻断: 在计划取样时间前约3-5小时，动物腹腔注射适量秋水仙素或秋水仙胺溶液。
4. 骨髓细胞采集:
   • 采用人道方式处死动物。
   • 迅速取出双侧股骨（或胫骨），剔除肌肉组织。
   • 剪去股骨两端，用注射器吸取预热至37°C的生理盐水（或低渗液）冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞悬液于离心管中。
5. 细胞处理:
   • 低渗处理： 离心弃上清，加入预热（37°C）的0.075 M KCl溶液，混匀，在37°C水浴中低渗处理15-30分钟（时间需优化）。
   • 预固定： 加入少量新鲜配制的固定液（甲醇：冰醋酸 = 3:1），轻轻混匀，离心。
   • 固定： 弃上清，加入固定液，混匀，室温下固定15-30分钟。此步骤重复2-3次。
   • 离心： 最后一次离心后，弃去大部分上清，保留少量固定液。
6. 制片:
   • 将细胞悬浮于少量新鲜固定液中。
   • 吸取少量细胞悬液，滴于洁净、预冷的湿玻片上（高度影响染色体分散），空气干燥或在酒精灯火焰上方快速过火干燥。
7. 染色: 使用稀释的Giemsa染液（如用磷酸盐缓冲液按1:10稀释）染色10-30分钟（时间需优化），自来水轻柔冲洗，晾干。
8. 阅片分析:
   • 在光学显微镜（油镜，1000倍）下观察中期分裂相。
   • 每只动物应分析足够数量的中期细胞（通常至少200个/性别，分散良好的中期相）。
   • 记录指标：
     • 细胞畸变率：含有至少一个染色体畸变的细胞数占分析细胞总数的百分比。
     • 畸变类型：区分染色体型和染色单体型畸变。
       • 染色体型畸变（主要关注）： 断裂（chromosome break）、断片（acentric fragment）、微小体（minute）、着丝粒环（centric ring）、无着丝粒环（acentric ring）、双着丝粒体（dicentric）、易位（translocation，需显带技术确认，镜下通常难以准确识别归为此类）、多倍体（polyploidy）、内（endoreduplication）。
       • 染色单体型畸变： 裂隙（gap，单独出现时通常不计入畸变）、染色单体断裂（chromatid break）、染色单体交换（chromatid exchange）等。
     • 畸变细胞率：含染色体型畸变的细胞百分比（常作为主要评价指标）。
     • 多倍体细胞率：含多倍体（通常指四倍体或更高）的细胞百分比。
     • 内细胞率：含内的细胞百分比。
   • 同时记录有丝分裂指数：观察视野中中期细胞数占总细胞数（包括间期细胞）的百分比，作为细胞毒性指标（需每组分析足够数量的细胞，如至少1000个细胞/动物）。
9. 统计分析:
   • 采用适当的统计学方法比较各剂量组与阴性对照组的畸变率差异（如卡方检验、Fisher确切概率法）。
   • 结果应呈现剂量-反应关系趋势（如果存在）。
   • 有丝分裂指数差异也可进行统计比较。

五、 结果评价标准

1. 阳性结果判定（表明受试物具有体内致染色体畸变活性）：
   • 至少一个剂量组出现统计学显著的染色体型畸变细胞率或细胞畸变率升高（与阴性对照组相比）。
   • 畸变率的增加具有剂量相关性（即随剂量增加而升高）。
   • 上述效应在生物学意义上是显著的（即升高幅度超出实验室历史阴性对照范围）。
2. 阴性结果判定（表明在本试验条件下未检测到受试物诱导染色体畸变）：
   • 所有剂量组的染色体型畸变细胞率或细胞畸变率与阴性对照组相比，无统计学显著增加。
   • 未观察到剂量相关性的畸变率增加。
   • 阳性对照组的畸变率显著高于阴性对照组，证明试验系统有效。
   • 有丝分裂指数显示适当的细胞毒性（高剂量组指数下降），或达到最大可行剂量，证明足够的骨髓暴露已经达到。
3. 不确定结果： 试验结果不符合明确阴性或阳性的判定标准（如仅在某个时间点/剂量组观察到临界显著的微弱升高，且无明显剂量关系），需要重复试验或进一步研究。

六、 质量控制

• 阴性对照： 必须设立，其畸变率应在实验室历史背景范围内。
• 阳性对照： 必须设立，且应诱导显著的染色体畸变率升高（远高于阴性对照）。
• 溶剂/赋形剂选择： 应确保对试验无干扰。
• 染色体制备质量： 中期细胞应分散良好，染色体形态清晰可辨。
• 阅片一致性： 最好由至少两位经验丰富的阅片者独立阅片，对畸变识别标准需达成共识并进行验证。
• 盲法阅片： 推荐采用盲法，即阅片者不了解标本所属组别。

七、 试验的局限性

• 主要检测断裂剂或影响染色体分离的化合物。
• 对某些需特定代谢途径激活的化合物可能不够敏感（骨髓自身的代谢活化能力有限）。
• 无法检测点突变或小的缺失/插入。
• 观察终点是特定时间点的染色体损伤累积，可能错过部分损伤（如快速修复）。
• 不能直接检测对生殖细胞的损伤。

八、 结论 哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验是遗传毒性标准试验组合的重要组成部分，提供化合物在体内诱导染色体结构损伤能力的直接证据。其结果对于化学品、药品、食品添加剂等的安全性评价至关重要。试验需严格按照国际公认的指南（如OECD指南475、ICH S2(R1)指南、中国国家标准GB 15193.8等）进行，确保科学严谨性和结果可靠性。试验结果的解读应结合其它遗传毒性试验结果和整体毒理学资料进行综合评估。

参考文献 (示例格式):

• OECD. (2016). Test No. 475: Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. OECD Publishing, Paris.
• ICH Harmonised Guideline. (2011). S2(R1) Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use.
• GB 15193.8-2014. 食品安全国家标准 哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验.
• Preston, R.J., Dean, B.J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A.F., & Shelby, M. (1987). Mammalian in vivo cytogenetic assays: analysis of chromosome aberrations in bone marrow cells. Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, 189(2), 157-165.

注意:

• 本文为完整的试验方法描述，严格避免了任何企业名称或商业产品名称。
• 在实际操作中，必须严格遵守实验室动物福利与伦理规范。
• 具体试验参数（如动物品系、体重范围、秋水仙素浓度与作用时间、低渗时间、固定次数、染色时间、每组动物数、分析细胞数等）需根据实验室的标准操作规程（SOP）和所遵循的特定指南（如OECD 475或国家标准）进行优化和确认。