细菌回复突变试验

发布时间：2025-06-17 08:05:28 阅读量：4 作者：生物检测中心

细菌回复突变试验：检测化学物质致突变性的基石

摘要： 细菌回复突变试验（常称为Ames试验）是利用特定组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）或色氨酸营养缺陷型大肠杆菌（Escherichia coli）菌株，检测化学物质诱导基因点突变（碱基对置换、移码突变等）能力的短期体外遗传毒性试验。该试验基于突变体细菌在受试物作用下能回复突变为原养型（可在不含所需氨基酸的培养基上生长）的原理，是国际公认的遗传毒性筛选核心方法，广泛应用于化学品、药品、食品添加剂、农药、化妆品等潜在致突变危害的初步评估。

一、 引言

遗传物质的稳定传递是生命延续的基础。化学物质诱导的基因突变（DNA序列的永久性改变）是遗传毒性最核心的表现形式之一，可能导致癌症、遗传性疾病等严重后果。因此，在化合物进入市场或被广泛使用前，对其进行遗传毒性评价至关重要。细菌回复突变试验因其简便、快速、经济、灵敏度高、遗传背景清晰等特点，自1970年代由Bruce Ames教授团队系统建立并优化后，迅速成为遗传毒性测试策略中最重要的一环，也是目前国际上应用最广泛的遗传毒性筛选试验之一。

二、 试验原理

  1. 营养缺陷型菌株： 试验选用一系列经过基因工程改造的组氨酸（鼠伤寒沙门氏菌）或色氨酸（大肠杆菌）营养缺陷型（His-或Trp-）突变菌株。这些菌株丧失了自身合成某种必需氨基酸（如组氨酸）的能力，只能在含有该氨基酸的培养基上生长。
  2. 回复突变事件： 当此类营养缺陷型菌株接触到具有致突变性的化学物质时，该物质或其代谢产物可能引起细菌DNA发生突变。如果这个新的突变恰好发生在原先导致营养缺陷的突变位点或其相关基因上，使其功能得以恢复（即发生回复突变），则该细菌就回复成为能够在缺乏相应氨基酸（如不含组氨酸）的基本培养基上生长的原养型（His+或Trp+）。
  3. 检测基础： 试验的核心是计数在缺乏必需氨基酸的选择性培养基（最小葡萄糖琼脂平板）上，受试物处理组与对照组（溶剂对照、阳性对照）相比，回复突变菌落（回复子）数量的显著增加。回复子数量的剂量依赖性增加是判断受试物具有致突变性的关键依据。

三、 试验关键要素

  1. 标准试验菌株：

    • 常用鼠伤寒沙门氏菌TA系列菌株：如TA98、TA100、TA1535、TA1537、TA102等。
    • 常用大肠杆菌菌株：如WP2系列（如WP2 uvrA、WP2 uvrA pKM101）。
    • 菌株特性设计： 不同菌株具有特定敏感性：
      • rfa突变（深粗糙型）：使细菌外膜脂多糖屏障缺陷，增加大分子化学物质的通透性。
      • uvrB突变（或ΔuvrB）：切除修复系统缺失，降低DNA损伤修复能力，提高对致突变物的敏感性。
      • pKM101质粒（如TA102、TA104、WP2 uvrA pKM101）：携带易错修复（SOS）相关基因（mucAB），增强对某些需要SOS反应激活的诱变剂的应答。
      • pAQ1质粒（如TA102）：携带突变靶点（hisG428）位于多重拷贝质粒上，增加检测某些诱变剂的灵敏度。
    • 选择多种菌株组合（通常至少包含4-5株），覆盖不同类型的突变（碱基置换、移码突变）并具备不同的修复能力和通透性，以提高检测广谱性。

  2. 代谢活化系统（S9 Mix）：

    • 目的： 许多化学物质本身不具有遗传毒性（前致突变物），但进入生物体后（主要在肝脏）经代谢酶（如细胞色素P450酶系）活化可转化为具有遗传毒性的终致突变物。为模拟体内代谢过程，试验需在加（+S9）和不加（-S9）代谢活化系统的条件下分别进行。
    • 组分： S9混合物（S9 Mix）通常包含：
      • S9组分： 啮齿动物（常用经酶诱导剂如Aroclor 1254或苯巴比妥/β-萘黄酮预处理的雄性大鼠）肝脏匀浆后经9000g离心所得的上清液（Post-Mitochondrial Fraction）。
      • 辅助因子： 提供代谢反应必需的辅酶，如NADP+或NADPH再生系统、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、MgCl₂、KCl等。
    • 使用： S9 Mix需在试验前新鲜配制并置于冰上使用。

  3. 受试物与对照：

    • 受试物： 需溶解或悬浮于适当的溶剂中（如蒸馏水、二甲基亚砜DMSO、丙酮等），配制不同浓度梯度。应进行溶解度或细胞毒性预试验以确定最高测试浓度（通常以出现轻微细胞毒性或沉淀为上限）。
    • 溶剂对照： 仅加入与处理组相同体积的溶剂，用于评估溶剂本身的影响。
    • 阳性对照： 在加和不加S9的条件下，使用已知的致突变物（如不加S9：叠氮钠、9-氨基吖啶、柔红霉素等；加S9：环磷酰胺、2-氨基芴等）来证明试验系统的响应能力。
    • 阴性对照： 在加S9条件下，加入不含受试物和阳性物的S9 Mix混合物；在不加S9条件下，则使用缓冲液或其他空白对照。

四、 试验方法（平板掺入法为例）

  1. 准备：
    • 将冻存的菌株在营养肉汤培养基中复苏培养，制备新鲜的过夜培养物。
    • 准备顶层琼脂（含少量组氨酸/生物素或色氨酸，保证有限的非突变分裂）。
    • 配制所需浓度的受试物溶液、溶剂对照液和阳性对照液。
    • 配制新鲜的+S9 Mix和-S9 Mix（仅含缓冲液）。
  2. 加样与孵育：
    • 在恒温水浴（45-48°C）中保温的顶层琼脂管（通常2ml体积）中依次加入：
      • 0.1ml测试菌液（含约1-2 x 10^8个活菌）。
      • 0.1ml受试物溶液/溶剂对照液/阳性对照液。
      • 0.5ml磷酸盐缓冲液（-S9试验）或0.5ml S9 Mix（+S9试验）。
    • 迅速混合均匀后，立即倾倒覆盖在预先凝固的最小葡萄糖琼脂平板表面上。轻轻晃动平板使顶层均匀分布。
    • 待顶层琼脂凝固后，翻转平板，放入37℃培养箱避光培养48-72小时。
  3. 菌落计数：
    • 培养结束后，计数每个平板上生长的回复突变菌落（回复子）。背景稀疏的菌苔（因顶层琼脂中含有限量组氨酸/色氨酸，允许细菌进行有限分裂形成的微弱菌苔）不应计入。
    • 使用菌落计数器或人工计数。

五、 结果判定与评价

  1. 试验有效性：
    • 溶剂对照组的回复突变菌落数应在该实验室历史对照数据范围内（通常提供历史对照范围）。
    • 阳性对照组必须显示回复突变菌落数显著高于溶剂对照组，证明试验系统和S9活性有效。
    • 受试物最高浓度组应未出现明显细胞毒性（表现为背景菌苔明显稀疏或消失）。
  2. 数据处理：
    • 计算每个剂量组和对照组回复突变菌落数的平均值和标准差。
    • 受试物各剂量组的回复突变菌落数通常与溶剂对照组进行比较。
  3. 阳性结果判定（关键）： 受试物引起回复突变菌落数出现剂量依赖性的、具有统计学意义（通常p<0.05）的增加，且在至少一个菌株（无论加S9与否）中出现可重复的两倍或以上的增加（通常要求达到或超过自发回变数的2倍），则判定为阳性（具有致突变性）。需注意：
    • 剂量依赖关系： 观察菌落数是否随受试物浓度增加而增加。
    • 可重复性： 结果应在独立的重复试验中得到验证。
    • 统计学显著性： 需进行适当的统计学检验（如t检验、方差分析、Dunnett检验等）。
    • 生物学意义： 统计显著性和倍数增加需结合判断，避免仅依赖单一的阈值。
  4. 阴性结果判定： 在满足试验有效性前提下，受试物在所有测试浓度（最高浓度应有轻微或无细胞毒性）、所有菌株、加和不加S9的条件下，均未引起回复突变菌落数出现剂量依赖性的、有统计学意义的显著增加（即未达到阳性判定标准），则判定为阴性（在本试验条件下未显示致突变性）。
  5. 模棱两可结果： 结果未达到明确的阳性或阴性标准（如仅在单一剂量点或单一菌株有轻微增加但未达2倍），通常需要重复试验或调整测试条件（如浓度范围、菌株组合）进一步确认。

六、 应用领域

  1. 化学品安全评估： 新化学物质注册（如REACH法规）、现有化学物质评价。
  2. 药品非临床研究： 新药研发中遗传毒性评价的标准组合试验之一（ICH S2(R1)指南）。
  3. 食品安全： 食品添加剂、包装材料迁移物、污染物潜在遗传毒性筛选。
  4. 农药登记： 评价农药原药及重要代谢物的遗传毒性。
  5. 化妆品原料安全： 化妆品法规要求的关键安全性测试项目之一。
  6. 环境污染物监测： 评估空气、水、土壤中污染物或复杂混合物的致突变性。
  7. 基础研究： 研究化学物质的致突变机制、结构与活性关系。

七、 优势与局限性

  1. 优势：
    • 高通量、快速、经济： 可在短时间内测试大量样本，成本相对较低。
    • 灵敏度高： 能检测多种类型的点突变。
    • 遗传背景清晰： 所用菌株的突变位点、修复缺陷、通透性改变等均有明确界定。
    • 代谢活化系统： 加入S9 Mix可有效检测前致突变物。
    • 标准化程度高： 有国际通用的测试指南（如OECD 471, US FDA Redbook, ICH S2(R1)），结果可比性强。
    • 公认度高： 经过数十年广泛应用验证，是国际公认的遗传毒性筛选“金标准”之一。
  2. 局限性：
    • 检测范围有限： 主要检测基因点突变（碱基置换、移码），对大片段缺失、染色体畸变、非整倍体等遗传终点不敏感或无法检测。
    • 与原核生物的差异： 所用细菌为原核生物，其DNA结构、修复机制、代谢途径等与真核生物（包括人类）存在差异。阳性结果提示潜在遗传毒性风险，但需谨慎外推至哺乳动物或人类。
    • 假阴性可能： 某些需特定代谢途径（非S9模拟）活化的化合物、仅作用于真核特异性靶点的化合物、具有杀菌性或干扰试验系统（如颜色干扰计数）的化合物可能漏检。
    • 假阳性可能： 某些在高浓度下产生细胞毒性并伴随DNA损伤（非直接致突变）的化合物可能呈现阳性（需结合其他试验解读）。某些菌株（如含pKM101质粒）对特定类型损伤高度敏感。
    • S9活性的变异性： S9来源（动物种属、品系、诱导剂、制备方法）、活性批次间可能存在差异。
    • 体内相关性： 体外试验结果需结合体内遗传毒性试验（如微核试验、染色体畸变试验）和致癌性研究进行综合评估。

八、 结论

细菌回复突变试验作为遗传毒性测试体系的核心组成部分，以其成熟、可靠、高效的特点，在保障化学品、药品、食品、化妆品等安全方面发挥着不可替代的作用。它为识别潜在的致突变危害提供了至关重要的第一步预警信息。然而，必须清楚地认识到其检测范围和生物学相关性（原核 vs 真核）的局限性。该试验结果通常需要与其他体外和体内遗传毒性终点试验的结果相结合，并充分考虑受试物的理化性质、毒代动力学特征和作用机制，才能对受试物对人类潜在的遗传毒性风险进行更全面、客观的综合评价。该试验持续的应用与研究改进（如高通量自动化、菌株/检测终点拓展）将进一步提升其在现代毒理学和安全科学中的价值。